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(共27张PPT)
探究 实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（图片来源：作者拍摄）
Q1：框线位置经过化粪池污物的堆积后，残留了很多
尿素，这些尿素会如何被植物利用？
Q2：土壤中含有多少这样的细菌，我们如何分离
它们？
探究 实践
实验设计——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
目的：
1.从土壤中分离能利用尿素的细菌
2.完成菌落的计数
3.了解能分解尿素的细菌在样品中的占比
实验思路：
1.从土壤中分离能利用尿素的细菌
——配制相应的选择培养基
资料1
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能够合成脲酶的微生物才能分解尿素。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000ml
2.菌落的计数
3.了解能分解尿素的细菌在样品中的占比
——稀释涂布分离法
——以牛肉膏蛋白胨培养基上的涂布结果为对照组
实验思路：
土壤取样
制备菌悬液与涂布平板
微生物的培养与观察
配制
培养基
稀释操作
确定分组
涂布操作
目的菌株的筛选和鉴定
菌落形态
观察与计数
实验思路：
土壤取样
微生物的培养与观察
制备
培养基
土样稀释
（制备菌悬液）
涂布平板
菌落
的计数
分析实验结果
制备培养基
①牛肉膏蛋白胨培养基
②以尿素为唯一氮源的选择培养基
土壤取样
①取样地点：
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长。
②取样过程：
铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋，在使用前都需要灭菌，操作完成后一定要洗手。
在无菌条件下，将1g土样加到有99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成102倍稀释的土壤稀释液。依此法制备103、104、105、 106、107倍稀释的土壤稀释液。取样时，尽量只取悬液。摇匀，放在试管架上。
1g土样
99ml无菌水
不同倍数稀释液
土样稀释（制备菌悬液）
（图片来源：常山一中陈美珍老师）
涂布平板
（图片来源：常山一中陈美珍老师）
★注意
测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养。在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将103～107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
（图片来源：百度图片）
涂布平板
选择培养基
牛肉膏蛋白胨培养基
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
（图片来源：百度图片）
涂布平板
Q1：每个浓度设置6个平板，1、2、3、4平板是尿素选择培养基，
5、6为牛肉膏蛋白胨培养基。每个培养基该如何涂布？
涂布平板
1
2
3
4
5
6
同一浓度的土壤稀释液
不进行涂布
与1、2、3同一浓度的土壤稀释液
Q2：如此涂布设置的目的是什么？
1、2、3作为实验组，且遵循平行重复原则。
4、5作为对照组一，若该培养基中无菌落生长，则说明未被杂菌污染。
6作为对照组二，判断尿素培养基是否具有选择作用，若该培养基上的菌落数目大于尿素培养基上的数目，则说明尿素培养基具有筛选作用。
涂布平板
1
2
3
4
5
6
同一浓度的土壤稀释液
不进行涂布
与1、2、3同一浓度的土壤稀释液
①培养条件：
细菌一般在30 ℃~37℃的温度下培养1-2天。
（图片来源：百度图片）
（图片来源：常山一中陈美珍老师）
微生物的培养与观察
微生物的培养与观察
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
1
2
3
4
5
6
菌落的计数与实验结果分析
以1×105倍稀释的稀释液涂布结果为例：
（46个菌落）
（实验组平均3个菌落）
1
2
3
4
5
6
（0个菌落）
案例分析1：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。根据结果请你分析，这两位同学的做法正确吗？ 如果有问题，错在哪？如何改进？
分析实验结果
微生物的培养与观察
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值
（1）甲同学在该浓度下涂布了一个平板，
统计的菌落数为230。
微生物的培养与观察
其中一个平板计数结果与其他两个相差太大。
微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
（2）乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为20、246、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值174作为统计结果。
案例分析2：丙同学认为在尿素培养基中分离出的微生物一定都是能分解尿素的微生物。你认为丙同学的想法正确吗？ 如果有不妥，你认为它们还可能是哪一类微生物？
微生物的培养与观察
不一定，可能某些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖，也可能是某些微生物可以直接利用空气中的氮气进行生长繁殖。
微生物的培养与观察
Q：如何进一步鉴定出土壤中分解尿素的细菌？
方法：在培养基中加入酚红指示剂
固体培养基上可以观察菌落周围出现红色环带
呈碱性，
遇酚红指示剂呈红色。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
课外拓展
活菌计数计数广泛应用于食品卫生、水源污染度的检验和土壤含菌量的测定等方面。如果你感兴趣，可以从下列项目中选做一个；并请走访相关部门或企业，了解它们是如何检测的。
1.空气中微生物总数的检测；
2.水中细菌总数的检测；
3.牛奶中细菌的分离与计数；
4.土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数。
感 谢 垂 听！

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