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3.2 基因工程的基本操作程序
本节聚焦:
1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
基因
表达载体
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
从社会中来
转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右)
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
苏云金杆菌的Bt 基因
普通棉花
能产生Bt 抗虫蛋白的抗虫棉
转入
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
导入
抗虫基因
（Bt抗虫蛋白基因）
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
实例：
主要步骤是？
(含抗虫基因）
（含有并表达抗虫基因）
一、目的基因的筛选与获取
1.什么是目的基因？如何筛选和获取目的基因？
2.PCR的概念？原理？条件？
任务一
【3min 自主学习】P76-77
PCR扩增仪
定义：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。
目的基因
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生Bt 抗虫蛋白，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“Bt基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
人胰岛素基因、
人干扰素基因等
抗虫基因、
抗病基因、
抗除草剂基因等
筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
1.筛选合适的目的基因
①序列数据库，如美国国家生物信息中心GenBank
②序列对比工具（如BLAST)
第一步：目的基因的筛选与获取
2.目的基因的获取和扩增方法
（1）获取方法
利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
第一步：目的基因的筛选与获取
人工合成
③ 从基因文库中获取 P82
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
全称
原理
操作环境
目的
优点
PCR技术
PCR扩增仪
自动控制温度
第一步：目的基因的筛选与获取
第一步：目的基因的筛选与获取
体内DNA复制的过程你还记得吗？
解旋酶
DNA聚合酶
▲子链的延伸方向：
模板：
原料：
能量：
酶：
DNA的两条母链
4种游离的脱氧核苷酸
解旋酶、DNA聚合酶
复制特点:
①边解旋边复制 ②半保留复制
碱基互补配对原则
（保证复制的准确进行）
要点回顾:体内DNA复制
条件
5'端→3'端
复制原则:
因为 DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。
ATP
第一步：目的基因的筛选与获取
想一想：体外进行DNA的复制需要哪些条件呢？
体内复制条件 体外复制条件
解旋 解旋酶 高温
模板 DNA母链 DNA母链
原料 4种游离的脱氧核苷酸 4种游离的脱氧核苷酸
合成子链 DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶
缓冲液（添加Mg2+）
2种引物
Mg2+的作用？
引物是什么，作用？
（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）
引物
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。
使DNA聚合酶从引物3’端开始连接脱氧核苷酸，延伸形成子链。
(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
a.什么是引物
b.引物的作用
使DNA聚合酶从引物3’端开始连接脱氧核苷酸，延伸形成子链。
(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
b.引物的作用
5’
3’
5’
3’
5’
3’
引物
引物
子链延伸
子链延伸
3’
5’
课后作业
背1.PCR的中文名称？PCR的原理？
2.PCR的过程中，如何打开双链DNA分子？
3.引物的作用？
4.缓冲液中添加Mg2+的作用？
一、目的基因的筛选与获取
1.PCR的过程
2.什么是变性、复性、延伸？
3.PCR的产物如何鉴定？
任务二
【3min 自主学习】P77-79
PCR扩增仪
耐高温的DNA聚合酶
DNA模板
引物
缓冲液
（一般添加Mg2+）
4种脱氧核苷酸
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
PCR仪
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
PCR反应的过程：
变性→复性→延伸
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
PCR反应的过程：
变性→复性→延伸
完成后，常采用 来鉴定PCR的产物。
琼脂糖凝胶电泳
问1：1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出 个DNA片段，即以_____形式扩增。　　　
指数
2n
问2：1个模板DNA分子经过n轮PCR，则共需消耗多少个引物？
共需消耗=2n×2 - 2 个引物
=2n－1 对引物。
DNA复制 PCR技术
场所
遵循原则
条件
解旋方式
酶
特点
结果
PCR技术 vs DNA复制
碱基互补配对原则
碱基互补配对原则
模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物
模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物(2种）
DNA在高温下热变性解旋
解旋酶催化
半保留复制、边解旋边复制
半保留复制、全解旋再复制
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶等
DNA连接酶
用PCR可以扩增mRNA吗？P79
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
二、基因表达载体的构建
1.基因工程的核心工作是？
2.基因表达载体的构建目的？
3.如何构建基因表达载体？
4.基因表达载体的组成？
任务三
【3min 自主学习】P80
基因表达载体的构建
2.目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
第二步：基因表达载体的构建
重组DNA分子
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
DNA连接酶
基因表达载体构建模式图
限制酶
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
质粒
同种限制酶
或能产生相同末端的限制酶
？
基因表达载体构建模式图
3.过程
第二步：基因表达载体的构建
4.组成
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
基因的上游（一段有特殊序列结构的DNA片段）
位置：
功能：
基因的下游（一段特殊序列结构的DNA片断）
终止转录
便于重组DNA分子的筛选
DNA复制的起点
第二步：基因表达载体的构建
目的基因
诱导型启动子
激活或抑制目的基因表达
标记基因
复制原点
启动子和终止子 VS 起始密码子和终止密码子
课后作业
背
1.变性、复性、延伸？
2.PCR的产物如何鉴定？
3.基因表达载体的组成？
4.启动子位于哪里？本质？作用？
5.终止子位于哪里？本质？作用？
6.基因工程的核心工作是？

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