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(共28张PPT)
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
1973年，科学家在美国黄石国家公园的热泉中筛选出耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
科学实例：
水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
耐高温的酶
耐高温生物体
耐高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
(1)筛选思路：
(2)启示：
启示：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。耐寒微生物耐热微生物石油分解菌同理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和PH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养基适用实验室微生物的筛选第一章 发酵工程
第2节 微生物的选择培养和计数
杆菌
球菌
霍乱弧菌
葡萄球菌
一、选择培养基
1.概念:
2.类型:
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80℃的高温
添加某种化学物质 加入青霉素
高浓度食盐
特殊碳、氮源 石油是唯一碳源
营养缺陷 不加碳源
不加氮源
水生栖热菌
酵母菌、霉菌等真菌
金黄色葡萄球菌
能消除石油污染的微生物
自养型微生物
固氮菌
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
　不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
二、微生物的选择培养
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
稀释涂布平板法——将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
稀释涂布平板法
系列梯度稀释
涂布平板
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
①铲取土样，将样品装入纸袋中
注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌
注意：移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成
1.样品的稀释：
2.涂布平板操作：
①取0.1mL 菌液滴加到培养基表面
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
稀释涂布平板法
稀释涂布平板法操作的注意事项：
⑴各操作细节要保证“无菌”，所有操作都应在酒精灯火焰旁进行。
⑵将涂布器浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
（3）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
样品的稀释
涂布平板
微生物的培养与观察
土壤取样
取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽，涂布器冷却后，再进行涂布。
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
每个稀释度下应涂布几个平板？为什么？
3.培养并观察培养基菌落：
待涂布的菌液被 后，将平板 ，放入30-37℃
中培养 d，在涂布有 菌液的平板上就可以观察到分离的 。
培养基吸收
倒置
恒温培养箱
1~2
合适浓度
单菌落
恒温培养箱
细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
计算公式：
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
1克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作
接种工具
菌体获取
优点
缺点
接种环在固体平板培养基
表面连续划线
接种环
在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
操作简单，可以根据菌落的特点
获得某种微生物的单细胞菌落
不能对微生物计数
①一系列的梯度稀释
②涂布平板操作
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
既可以获得单细胞菌落，
又能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
涂布器
共同点
都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征。
三、微生物的数量测定
稀释涂布平板法（间接测定微生物数量）
①原理：
利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
血细胞计数板：
细菌计数板：
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
②缺点：
a.不能区分死菌和活菌→偏大。
b.不适于对运动细菌的计数。
c.需要相对高的细菌浓度。
d.个体小的细菌在显微镜下难以观察。
③优点：
快速、直观
显微镜直接计数法（直接测定微生物数量）
一
计数用具—血细胞计数板
XB.K.25
0.10mm
1/400mm2
量制滬字
02270113號
横面观
侧面观
计数室
边长为1mm
深度为0.1mm
1个计数室的体积为0.1mm3，1个计数室有400个小方格。
每个小方格的体积是1/4000mm3。
方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。
②中方格
③小方格
（双线分割）
①大方格
计数用具—血细胞计数板
一
16×25型
计数公式：
A1
A2
A3
A4
A1、A2、A3和A4分别为四个中方格中的酵母菌数。
1mL样品中酵母菌数
A1+A2+A3+A4
4
×16 × 10 × 1000×稀释倍数
=
如何利用血细胞计数板对酵母菌进行计数？
25×16型
A1
A2
A3
A4
A5
计数公式：
1mL样品中酵母菌数
A1、A2、A3 、A4和A5分别为五个中方格中的酵母菌数。
A1+A2+A3+A4+A5
5
×25 × 10 × 1000×稀释倍数
=
它们的区别就是计数室的高度不同，细菌计数板计数室的高度是0.02 mm。
故细菌计数板计数细菌的计算是：
细菌细胞个数/mL=
每个小方格平均细胞数×400
2×10-5
×稀释倍数
0.02mm3=0.02×10-3cm3=2×10-5mL
血细胞计数板和细菌计数板
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
P18 探究 实践
1.原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2.配方：
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，
用以尿素为唯一氮源的培养基做实验组，
用来判断选择培养基是否具有选择作用。
①提供无机盐；
②调节pH。
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定,是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3 再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以为细菌生长的氮源。
在以尿素为唯一氮源的培养基上加入酚红指示剂，培养某种细菌后，若pH升高，指示剂将变红，这样说明该菌能够分解尿素。
怎样判断筛选出来菌就是能够分解尿素的菌呢？可以用什么去鉴定呢？
土壤取样
①要求：富含有机质、酸碱度接近______且潮湿的土壤
②取样土层：铲去_________，在距地表3~8cm的土壤层
制备培养基
①实验组：以尿素为唯一氮源的选择培养基
②对照组：
样品的稀释
牛肉膏蛋白胨培养基(普通培养基）
目的：作为对照组用以判断选择培养基是否具有选择作用
涂布平板
2.实验设计流程
中性
表层土
①稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数
②稀释标准：测定土壤中的细菌的数量，一般选用_____________________________倍
稀释液进行平板培养
1×104、1×105和1×106
③初次实验，可以将稀释的范围放宽一点，例如可以将___________________倍稀释液
分别涂布培养，以保证___________________________________________。
1×103~1×107
能从中选择出菌落数为30~300的平板进行计数
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
涂布平板
每个稀释浓度至少设置4个平板。
1、2、3平板是 ______培养基（_____组，三个重复），4为________________培养基，目的：用以 _____________________________。
思考1：另外，整个实验还要设置2个平板（对照组），是哪两个目的？
（1）另设置2个平板：
①未涂布（未接种)的选择培养基
②未涂布的牛肉膏蛋白胨培养基；
（2）目的：以验证培养基中是否含有杂菌；
与接种的选择培养基形成对照
与接种的牛肉膏蛋白胨培养基形成对照
判断选择培养基是否具有选择作用
选择
实验
牛肉膏蛋白胨
菌落计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。
稀释度 104 105 106 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
每个平板的菌落数
培养与观察
将平板____于________℃的恒温培养箱中培养1~2天。每隔24小时统计一次菌落数目,选取________________时的记录做结果
倒置
30~37
菌落数目稳定
为什么？
防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
(1)无菌操作:
(2)做好标记:
(3)规划时间:
本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
①取土样的用具在使用前都需要 。
②实验操作均应在 _______ 进行。
操作提示
灭菌
酒精灯火焰旁
本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的 ______ 等。
稀释度
1、结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2、你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
结果分析与评价
4、得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
5、进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
需要用“鉴别培养基”
3、你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少 与其他同学统计的结果接近吗 如果差异很大，可能是什么原因引起的
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计

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