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天然菌种
菌种差异
杂菌情况不明
发酵过程的控制缺乏标准等
发酵食品的品质不一
为缩短发酵时间，确保品质好且稳定（无杂菌污染），工业上大规模生产时，通常会先通过微生物的培养技术获得单一菌种，再将它们接种到物料中进行发酵。
天然菌种
菌种差异
杂菌情况不明
发酵过程的控制缺乏标准等
发酵食品的品质不一
自制酸奶因杂菌污染致肠胃不适
制作泡菜中有杂菌混入
①容器和原料灭菌
②接种纯的菌种
③在无菌条件下操作
思考：怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
江西生物组 东东老师
学习目标：
1．概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。
2．阐明微生物选择培养的原理。
3．进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
难以用肉眼观察的微小生物
微生物
有细胞结构
无细胞结构:
真核生物
原核生物:
原生生物:
真菌:
草履虫、变形虫等
酵母菌、霉菌等
（真）病毒、亚病毒（只有环状RNA类病毒、只含核酸寄生病毒的拟/卫星病毒、朊病毒）
立克次氏体/放线菌/衣原体/支原体/细菌/蓝细菌
本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
实验室微生物的基本培养技术:
（1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
（2）确保其它微生物无法混入
微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。
（3）并将需要的微生物分离培养出来
培养基
无菌技术
纯化培养
培养基
培养环境
无菌技术
分离培养
Ⅰ微生物的基本培养技术
细菌
放线菌
霉菌
酵母菌
培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物，有液体培养基、半固体/固体培养基。
培养
分离
鉴定
保存
菌落：单个微生物细胞接种到培养基表面/内层时，当它占有一定发展空间并处适宜条件下，该细胞会迅速生长繁殖形成一堆肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。
思考：什么是培养基？它有何用途？它有何种类？它的必备营养成分有哪些？
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加琼脂(98℃以上融化,44℃以下凝固,不提供能量和营养)等凝固剂
加凝固剂，如1.5%～2.0%琼脂
工业大规模快速繁殖某微生物
观察微生物的运动、分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含成分不明确的蛋白胨/牛肉膏/酵母浸粉等天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
允许特定种类微生物生长，同时抑制/阻止其他微生物生长的培养基
培养、分离出特定微生物
培养基中加入某种指示剂或化学药品，用以鉴别不同种类的微生物
天然培养基
合成培养基
固体培养基
液体培养基
半固体培养基
选择培养基
鉴别培养基
通用培养基
加凝固剂，如0.3%～0.7%琼脂
通用培养基营养物质齐全，可以满足多种微生物的营养需求
鉴别不同种类的微生物
用于培养多种微生物
一、培养基的配制
思考：培养基必备营养成分有哪些？如何配制培养基满足不同微生物特殊需求？举例说明。
1000mL牛肉膏蛋白胨培养基组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏（源于动物，含糖、维生素和有机氮等） 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源(合成含氮物质)、碳源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 1000mL 水
①碳源
无机碳源：
有机碳源：
②氮源
NH4＋、NO3-、NH3等。
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。
CO2、CO32-、HCO3-。
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。
无机氮源：
有机氮源：
③无机盐
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等
大量元素：
微量元素：
Ca、K 、Mg等
（异养微生物）
（自养微生物）
（自养微生物）
（异养微生物）
④水
培养基
基本成分
微生物 碳源
蓝细菌 CO2
硝化细菌 CO2
根瘤菌 糖类等有机物
大肠杆菌 糖类、蛋白质等有机物
自养型微生物通过自身光合作用/化能合成作用合成有机物，能利用无机碳源；异养型微生物不能自身合成有机物，只能利用现成有机碳。
思考：培养基只有基本成分就够吗？
③培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；
②培养霉菌时，需要将培养基调至酸性；
④培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性；
还需满足微生物对pH、特殊营养物(主要是生长因子)和O2的需求
生长因子是微生物自身不能合成或合成不足，但又是微生物生长代谢必需，但不能用简单碳、氮源自行合成的小分子有机物，如维生素、氨基酸、碱基、卟啉、胺类等。酵母膏、玉米浆、麦芽汁、牛肉浸膏、蛋白胨、动植物组织提取液等天然物质含有不同生长因子。
培养基营养成分的含义、作用、主要来源分析
营养物质 含义 作用 主要来源
碳源 凡能提供所需碳元素的物质 构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质 无机碳源：NaHCO3、CO2等；
有机碳源：糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油、牛肉膏和蛋白胨等
氮源 凡能提供所需氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机氮源：NH3、铵盐、硝酸盐等；
有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
水 在高等生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高 不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定 培养基、大气、代谢产物等
无机盐 为微生物提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素 细胞内的组成成分；生理调节物质；某些化能自养菌的能源；酶的激活剂 培养基、大气等环境
想一想
是不是所有微生物的培养基都需要加入碳源、氮源？
不是
光合细菌：不需要加入碳源
固氮菌：不需要加入氮源
判一判
①同一种物质不能既做碳源，又做氮源。（ ）
②碳源都能提供能量。（ ）
③无机氮源也能提供能量。（ ）
④除水以外的无机物只提供无机盐（ ）
×
×
√
×
一、培养基的配制
无菌技术：获得纯净的微生物培养物的关键是 。无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括 ，如对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒，对培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
消毒和灭菌
消毒：使用较为 的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
灭菌：强烈理化方法杀死 的微生物，包括芽孢和孢子。
温和
物体内外所有
防止杂菌污染
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：62-65℃煮30min或 80℃-90℃下处理30s-1min。可杀死绝大多数微生物，不破坏食物营养成分。（啤酒、人乳及婴儿合成食物等）
③紫外线消毒法：对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气的微生物。
Ⅰ物理方法：
Ⅱ化学药物消毒：如氯气消毒水源，采用碘酒、体积分数为70%的酒精、双氧水等化学药剂，对实验室的空间、操作台表面、实验人员工作服与手等进行消毒等。
Ⅲ生物消毒法：利用生物或其代谢物除去环境部分微生物的方法。例如，有的微生物能寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可用它们来净化污水、污泥。
有些细菌生长到一定阶段在一定条件胞里形成一个椭圆形休眠体(不是繁殖体)，叫作芽孢。芽孢的壁很厚，可抵抗化学药物、辐射、干旱、低/高温等恶劣的环境。有的细菌芽孢煮沸3h后才死亡。芽孢小又轻，可随风飘散。当温度、水分等环境适宜时，芽孢又可萌发，形成一个细菌。
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。孢子的特点是能直接长成新个体。孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞。有时候可直接由营养细胞通过细胞壁加厚和积贮养料而形成，能抵抗不良环境条件。
无菌技术：获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒（使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物，如煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。巴氏消毒法：62-65℃煮30min或 80℃-90℃下处理30s-1min。可杀死绝大多数微生物，不破坏食物营养成分。（啤酒、人乳及婴儿合成食物等）紫外线消毒法：对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气的微生物。化学药物消毒：如氯气消毒水源，采用碘酒、体积分数为70%的酒精、双氧水等化学药剂，对实验室的空间、操作台表面、实验人员工作服与手等进行消毒等。）和灭菌（强烈理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子）。
二、无菌技术
（1）湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽对培养基、无菌水等进行灭菌（高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性）的方法。实验室常用高压蒸汽灭菌锅，在压力100kPa、温度121 ℃条件下，维持15-30min。操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
（2）干热灭菌：干热灭菌箱内，对耐高温需保持干燥的物品、玻璃器皿 （如试管、培养皿、吸管、注射器）和金属器具 （如针头、 镊子、剪刀等）在160-170 ℃的热空气中维持下2-3h达到灭菌（使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等）目的。
（3）灼烧灭菌：涂布器、接种环\针、其他金属用具等接种工具、试管口瓶口等直接在酒精灯火焰充分燃烧层灼烧，迅速彻底灭菌(燃烧微生物)。
比较消毒和灭菌对微生物作用效果的差异
项目 消毒 灭菌
作用强度 较为____ 　　的物理、化学因素
消灭微生物 的数量 物体表面或内部　　　微生物 物体内外的　　微生物
能否消灭 芽孢、孢子 消灭 芽孢 能消灭 芽孢和孢子
适用对象 操作空间、操作者的衣着和手等 接种环、接种针、
玻璃器皿、培养基等
常用方法
温和
强烈
一部分
所有
部分
全部
煮沸消毒法、巴氏消毒法、
化学药剂消毒法、紫外线消毒法
湿热灭菌、干热灭菌
灼烧灭菌
注意：做好消毒和灭菌工作后，要避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
（1）培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
（2）纯培养：获得纯培养物（由单一个体繁殖所获得的微生物群体）的过程，包括配制培养基、灭菌、接种、分离、培养步骤。
三、微生物的纯培养
如细菌菌落光滑，易与基质脱离；
放线菌菌落质地致密，菌落较小而不致广泛延伸；
酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；
霉菌形成的菌落较疏松，多呈绒毛状、絮状。
菌落：单个微生物细胞接种到培养基表面/内层时，当它占有一定发展空间并处适宜条件下，该细胞会迅速生长繁殖形成一堆肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。不同菌落大小、形状、颜色、光泽度、透明度、隆起程度等不同，是鉴定菌种的重要依据。
本节小结

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