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(共47张PPT)
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。
普通棉花
如何能培育出自身就能抵抗虫害 的棉花新品种呢？
转基因抗虫棉
第3章 基因工程
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因 转入普通棉花
学习目标
1.通过资料分析，阐明基因工程的理论基础。
2.通过模拟制作活动，阐明限制酶、DNA连接酶和载体的作用。
3.通过了解基因工程的发展历程，认同基因工程的诞生和发展离不开多个学科的理论研究和技术创新。
1.基因工程的概念：
基因工程是指按照人们的愿望，通过________等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做__________技术。
例如，通过重组DNA技术，可以实现利
用大肠杆菌生产人的胰岛素。在此实例中，
目的基因是_______________，受体细胞是
________________，目的基因的表达产物是
____________。
转基因
重组DNA
人胰岛素基因
大肠杆菌细胞
人胰岛素
2.对基因工程概念的理解：
基因工程的别名：
操作对象：
操作水平：
基本过程：
原 理：
结 果：
重组DNA技术、转基因技术
基因（DNA）
DNA 分子水平
剪切→拼接→导入→表达
基因重组
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状
优 点：
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
3.基因工程理论基础的分析
【问题探究1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
（1）DNA的基本组成单位都是 。
（2）双链DNA分子的空间结构都是 。
【问题探究2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
（1） 是控制生物性状的独立遗传单位。
（2）遗传信息的传递和表达都遵循 。
（DNA复制、转录、翻译等都遵循 ）
（3）生物界共用一套 。
四种脱氧核苷酸
规则的双螺旋结构
基因
中心法则
碱基互补配对原则
遗传密码
A
T
G
C
腺嘌呤
胸腺嘧啶
胞嘧啶
鸟嘌呤
4种
脱氧核苷酸种类？
o
1’
2’
3’
4’
5’
脱氧
核糖
【回顾】DNA
DNA的基本单位？
脱氧（核糖）核苷酸
中文全称？
脱氧核糖核酸
一条脱氧核苷酸链
…
（3 ’、 5’）磷酸二酯键
5′
5′
3′
3′
A
P
脱氧
核糖
G
P
脱氧
核糖
T
P
脱氧
核糖
C
P
脱氧
核糖
脱氧
核糖
G
P
A
P
C
P
T
P
脱氧 核糖
脱氧 核糖
脱氧核糖
氢键
DNA的平面结构
一端有一个游离的磷酸基团
另一端有一个羟基（—OH）
科技探索之路
基因工程的诞生与发展
基因工程发展历程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
《金》P81例1、例2
【从社会中来】
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
转基因番木瓜
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
培育转基因番木瓜
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
磷酸二酯键
1.来源：
2.功能：
3.作用的化学键：
磷酸二酯键
主要从 中分离纯化出来，目前分离出数千种。
识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开
磷酸二酯键
原核生物
注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。
（酶的专一性）
EcoRⅠ
限制性内切核酸酶
一
“分子手术刀”——
（简称限制酶）
4.识别序列长度：
5.结 果：
限制酶识别序列的长度一般为4-8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
产生黏性末端或平末端
限制酶名字的由来
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名大肠杆菌coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
资料卡P72
EcoRⅠ：
专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间的磷酸二酯键断开。
A. 形成的黏性末端（从5’往3’读）为________
B. 一个限制酶切割一次，断开___个磷酸二酯键，形成___个黏性末端
C. 同一种限制酶切割形成的黏性末端相同吗？_____。不同限制酶切割呢？
D. 两个黏性末端有___个游离的磷酸基团，消耗 分子水
AATT
两
相同
2
黏性末端
（1） 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
两
两
末端一般不同，可能相同。不一定不同。
中轴线
平末端
Sma I：
专一识别CCCGGG的序列，并使G和C之间的磷酸二酯键断开。
（2） 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
重组DNA分子的模拟操作 P73讨论
请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列：
1、找到两条片段上EcoRI限制酶识别的序列和切割位点，然后用剪刀进行“切割”。
识别序列GAATTC
G与A之间
【问题探究1】请判断：以下黏性末端是由几种限制酶作用产生的？
3
①
②
③
结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。
（末端一般不同，可能相同）
【问题探究2】下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：
（1）用EcoR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段；
（2）用PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（3）同时用SmaⅠ 和PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（4）只用PstⅠ 酶切，最多能得到 种DNA片段。
2
3
5
5
解释（4）：PstⅠ酶切左边第1个位点，得到2种片段；PstⅠ酶切右边第2个位点，得到另外2种片段；PstⅠ同时酶切左右2个位点，得到3种片段，但是最左、最右片段重复，实际总片段是2+2+3-2=5种。
细菌等原核生物容易受到自然界外源DNA（如噬菌体）的入侵。所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。这类原核生物之所以长期进化而不灭绝，限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
思考：1.根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
2.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
细菌自身的DNA没有限制酶识别的特定序列或者识别序列被修饰（甲基化），所以不会限制酶切割自身的DNA。
【课后题拓展应用2】有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？
XbaⅠ
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）
结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
1.作用：
2.DNA连接酶—“分子缝合针”
3.种类：
类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 ____________ ____________
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
磷酸二酯键
2.作用部位：
两个DNA片段要具有互补（相同的）黏性末端才能连接起来
把两个DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接两个双链DNA片段中的DNA单链缺口，但不能直接连接两条单链的DNA！
（1）.E·coli DNA连接酶的缝合作用：
DNA连接酶将两个双链DNA片段“缝合”连接起来，形成一个双链DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
T4 DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。
（1）.T4 DNA连接酶的缝合作用：
？插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
C
A
A
T
T
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
连接单个脱氧核苷酸形成单链
DNA聚合酶作用示意图：
易混易错
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA (水解)酶
解旋酶
归纳总结——与DNA相关的五种酶的比较
DNA
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对之间
的氢键
将双链DNA切成两个或多个片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将单个脱氧核苷酸依次连接到
单链末端
将DNA片段水解为单个脱氧
核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
DNA
DNA片段
脱氧核苷酸
磷酸二酯键
DNA
《金》P81 点拨提高
将外源基因送入受体细胞，相当于一种运输工具，比喻为“分子运输车”
1.种类：
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
2.最常用的载体——质粒
是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
DNA分子复制的起点
特殊的标记基因
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
标记基因通常有:
①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)
②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
质粒有___个游离的磷酸基团
0
3.★载体作为载体所具备的条件及原因
①有一个至多个限制酶切割位点
供外源DNA片段（基因）插入其中
②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量
③具有特殊的标记基因
便于重组DNA分子的筛选
④无毒害作用
避免受体细胞受到损伤
4. 质粒的作用
①作为运输工具，将外源基因导入受体细胞。
②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GCCGTATG…
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
实例： 重组DNA分子的模拟操作
1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因
规律：---选择酶切位点的原则：
《金》P82 例4、P83 7
1.“分子手术刀”——
1）来源：
2）作用：
3）作用结果：
2.“分子缝合线”——
1）作用：
2）分类：
3.“分子运输车”——
1）作用：
2）种类：
3）应具备条件：
限制酶
产生黏性末端、平末端
DNA连接酶
将不同的DNA片段连接起来
磷酸二酯键
将外源基因送入受体细胞
质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）
主要从原核生物中分离纯化出来。
载体
识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位：
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
小结：基因工程的基本工具
用限制酶切割时需注意的事项
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
(3)选择限制酶切割位点的基本原则：
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
两
4
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
练习与应用
《金》P85 17
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA粗提取的原理
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
1.DNA不溶于酒精溶液
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
在 NaCl溶液中的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
探究-实践
DNA的粗提取与鉴定
在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
3.DNA 的鉴定
当NaCl的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。
不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
你认为如下提供的材料中哪些不适合提取DNA？为什么？
供选材料：（括号内为染色体条数）
新鲜洋葱（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、猕猴桃（58）；猪肝（38）、鱼卵、鸡血（78）、哺乳动物的成熟红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌（1）
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑；选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
1、实验材料的选取
材料用具
利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
方法步骤
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
1. 研磨洋葱
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
2. 过滤获取含DNA的上清液
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
3. 冷却酒精析出DNA
1.研磨洋葱 2.过滤获取含DNA的上清液 3.冷却酒精析出DNA 4.DNA的鉴定
破坏细胞，释放出细胞内的物质
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
析出DNA
玻璃棒不要直插烧杯底部
其中除了含DNA，可能还含有核蛋白、多糖等杂质
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；
向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
4. DNA的鉴定
取两支20mL的试管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。
方法步骤
1号试管 2号试管
加入2mol/L NaCl溶液 5mL 5mL
丝状物(DNA) 不加 加入
用玻璃棒搅拌 无 丝状物溶解
加入二苯胺试剂 4mL 4mL
沸水浴 5min 5min
观察现象 不变蓝 变蓝
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
不变蓝
变蓝
对照组
实验组
*溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
跟踪训练
4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
跟踪训练
A.①是c；②是b；③是a
B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a
D.①是c；②是a；③是b
√
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
跟踪训练
第①组：细菌在含氨苄青霉素和四环素的培养基上都能生长，说明氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因均没有被破坏，外源基因插入的位置是c；
第②组：细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，不能在含四环素的培养基上生长，说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，四环素抗性基因被破坏，外源基因插入的位置是b；
第③组：细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因没有被破坏，外源基因插入的位置是a。综上所述，A正确。
课堂小结

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