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第二章 动物细胞工程
2.2.3 动物体细胞核移植技术和克隆动物
核移植。
1.克隆猴用到了什么技术？
动物细胞核具有全能性。
2.为什么用供体猴的一个细胞核进行移植就可以培育出与它几乎一模一样的克隆猴？
动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。
3.胚胎细胞克隆猴与体细胞克隆猴有什么不同？ 为什么体细胞克隆猴的诞生能够轰动世界？
哺乳动物核移植的类型及特点
非人灵长类动物体细胞核移植非常困难的两个原因
种类 难易程度 原因
胚胎细胞核移植
体细胞核移植
较容易
较难
分化程度低，全能性易表现
分化程度高，全能性难表现
供体的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；
非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。
目录
CONTENTS
体细胞核移植的过程
一、
体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
二、
一般指DNA分子扩增，如PCR技术，还包括单克隆抗体技术。
由一个细胞分裂所形成的细胞群体，如动物细胞培养技术、植物细胞培养技术。
分子水平：
细胞水平：
个体水平：
在生物学上，克隆是无性繁殖，具体地说，是指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的分子、细胞或个体。
克隆技术：是一个很广的概念，凡指新形成的事、物与亲本一致的现象均可称为“克隆”。
指基因型完全相同的个体或群体，如植物组织培养技术、核移植技术。
1997年，美国的一个奶牛场有一头名叫卢辛达的奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4t。
思考：能否依据“多莉”的培育过程，进行优质奶牛的快速繁育？
联系克隆高产奶牛的流程，请分析、讨论以下问题，并完善流程。
1.请用箭头和文字画出体细胞核移植的过程。
2.选择卵母细胞作为核移植受体细胞的原因？采集的卵母细胞应培养至 ；卵母细胞为什么要“去核”？卵母细胞去核的方法？
3.注入去核的卵母细胞的是整个供体细胞还是供体细胞的细胞核？为什么？
4.诱导融合的方法？融合的结果？
5.什么是重构胚？激活重构胚的方法？用这些方法处理重构胚的目的？
6.该过程用到了哪些动物细胞工程的技术手段？
相关消息：
减数分裂Ⅱ中期（MⅡ期)的卵母细胞中的“核”其实是：
文中所说的“去核”是去除纺锤体-染色体复合物。由于MⅡ期卵母细胞核的位置靠近第一极体，用微型吸管一般一并吸出第一极体。
核：纺锤体-染色体复合物
次级
卵母细胞
第一极体
MⅡ期：减数第二次分裂中期
卵母细胞去核：
2)普遍使用的去核方法是显微操作法。
也有人采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。
1)去核的原因
保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞。
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
从高产奶牛（供体）取体细胞
通过显微操作去核
（去除纺锤体-染色体复合物）
动物细胞培养
将供体细胞注入去核卵母细胞
保证核移植动物的核遗传物质全部来自供体细胞。
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚。
激活重构胚使其完成细胞分裂和发育进程
早期胚胎
用物理或化学方法：
（电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等）
将胚胎移入（受体）代孕母牛体内
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛（克隆牛）
问题1:为何选用MⅡ卵母细胞
①其细胞质中含有激发细胞核全能性表达的物质；
②卵母细胞体积大，易操作；
③卵母细胞营养物质丰富。
问题2:卵母细胞为什么要“去核”？
保证核移植的胚胎或动物的核遗传物质全部来自供体细胞。
①对卵母细胞损伤较小；
②保证供体细胞的细胞核不被破坏，操作方便。
问题3:将整个供体细胞注入卵母细胞中有何优点？
问题4:激活重构胚目的是？
用物理或化学方法(如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚胎，使其完成细胞分裂和发育进程。
早期胚胎培养
动物细胞培养
胚胎移植
动物细胞融合
重构胚
早期胚胎
两细胞融合
激活重构胚
采集牛卵母细胞，体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
核移植
高产奶牛（供体)
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
显微操作去核
取体细胞
将胚胎移入受体（代孕)母牛体内
动物体细胞核移植
整个过程中应用到的技术：
1)动物细胞培养
2)动物细胞融合
3)早期胚胎培养
4)胚胎移植
5)动物细胞核移植
(1)诱导动物细胞融合常用的方法有：PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法；激活重构胚的常用方法有电刺激、Ca2＋载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等。
(2)克隆动物技术属于无性繁殖技术。
(3)动物体细胞核移植的原理是细胞核的全能性，而不是动物细胞的全能性。
(4)核移植技术中的供体是提供细胞核的动物个体；受体是代孕的雌性动物个体，而非提供去核卵母细胞的动物个体。
(5)动物体细胞核移植过程中，涉及的技术手段不仅有核移植技术，还有动物细胞融合技术、动物细胞培养技术，以及早期胚胎培养技术和胚胎移植技术等。　　　　　　　　　　
2)细胞质中的DNA（线粒体中的DNA)同时来自供体细胞和受体卵母细胞，一部分性状和卵母细胞受体一致；
3)生物性状还受到环境因素的影响，克隆动物所生活的环境与核供体动物生活的环境不会完全相同。
克隆动物的性状表现：
表现型 = 基因型 + 环境
1)克隆动物绝大部分DNA来自供体动物的细胞核，绝大多数性状和核供体一致；
问题5:体细胞核移植方法生产的克隆动物，是不是对体细胞供体动物进行了100%的复制？为什么？
动物的发育及一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，克隆动物所生活的环境与核供体动物生活的环境不会完全相同。
克隆动物遗传物质
细胞核的DNA
来自于供体动物的细胞核
线粒体中的DNA
供体细胞和受体卵母细胞
生活环境：
不是对核供体动物进行100%的复制。
加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育
1
畜牧业
器官移植，利用生物反应器进行药物生产
2
医疗卫生
研究生物的发育、衰老、疾病致病机理等
3
科学研究
该技术有望增加濒危物种的存货数量
4
其它领域
（一）体细胞核移植的应用前景
1.在畜牧生产中：
可以加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育
（一）体细胞核移植的应用前景
2.在医药卫生领域：
①通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白。
乳腺生物反应器
（一）体细胞核移植的应用前景
②在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以用于异种移植。
③以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免发生免疫排斥反应。
2.在医药卫生领域：
（一）体细胞核移植的应用前景
3.在科研领域：
①研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程。
②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因。
③克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。
4.在保护濒危物种方面：
白鳍豚
该技术有望增加濒危物种的存活数量
（一）体细胞核移植的应用前景
1. 成功率低，胚胎移植—动物幼体产出概率＜10％
（二）体细胞核移植技术存在的问题：
3. 绝大多数克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。
易出现早衰（多利羊猜想）。
2. 核移植的理论研究较为滞后，需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等更深层次的理论研究相结合。
相关资料：
培育克隆羊多莉时，共获得了277个融合的细胞，早期发育成功的胚胎却只有29个，移植后成功怀孕的母羊仅有1只，成功率只有0.36%。培育体细胞克隆猴时，用了127个卵母细胞，获得109个核移植胚胎，移植给21只代孕母猴，只有6只成功怀孕，最后只诞生了2 只健康的小猴，成功率为1.57%。
多莉在2003年2月15日，因肺部感染而死亡，寿命只有7岁，而普通羊的平均寿命是12岁。
概述
过程
动物细胞核移植
结果
生殖方式
原理
分类
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
胚胎移植
早期胚胎培养
前景和问题
畜牧生产、保护濒危物种、
医药卫生、科研
成功率低、
理论研究滞后、
健康问题
1.假设世界上最后一头野驴刚死亡，以下使它“复生”的方案中可行的是（ ）
A.将野驴的基因导人家驴的受精卵中，培域植育出新个体
B.将野驴的体细胞取出，利用组织培养培育出新个体
C.将野驴的体细胞两两融合，再经组织培养培育出新个体
D.将野驴的体细胞核移植到家驴的去核卵母细胞中，经孕育培育出新个体
D
2.2017年，某国批准了首例使用细胞核移植技术培育“三亲婴儿”的申请。其培育过程可选用如下技术路线。据图分析下列叙述错误的是
A.该技术涉及动物细胞培养、细胞核移植等操作
B.该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代
C .卵母细胞捐献者携带的红绿色盲基因能够遗传给“三亲婴儿”
D .“三亲婴儿”同时拥有自己父亲、母亲及卵母细胞捐献者的部分基因
C
3.某医院病理室为确诊一患者的肿瘤是良性还是恶性，切取了一小块肿瘤组织进行培养．请回答下列问题：
（1）培养之前，肿瘤组织必须先用__________ 等处理成单个细胞．
（2）若开始培养时取一滴培养液观察有100个肿瘤细胞，经24h培养后，取一滴稀释100倍后再取一滴（设三次的“一滴”等量）观察，发现有64个肿瘤细胞，此肿瘤的细胞周期约为_____h．
（3）与正常细胞相比，在显微镜下可见明显增多的细胞器是____________________（填两项）
（4）某科研单位研制出一种新型治癌药物X，但不知对此类肿瘤是否有疗效，请你设计一个方案加以验证．完成实验步骤：
①将相同的培养液分为相等的两份，一份_________________，
一份______________
②___________________________________
③放在相同的条件下培养，______________________
胰蛋白酶
4
线粒体、核糖体
加入药物X
不加入药物X
将等量的肿瘤细胞置于两份培养液中
观察肿瘤细胞生长情况

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