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第2节 微生物的培养技术及应用
非细胞型：病毒
细胞型
细菌
真菌
微生物
原生生物
（一）培养基的配置
2.分类：
1.定义：按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长 繁殖的营养基质。
一、微生物的基本培养技术
3.营养组成：水、碳源、氮源、无机盐
①碳源：为微生物提供所需碳元素的营养物质。
如：CO2、NaHCO3；石油、牛肉膏、蛋白胨、糖类、脂肪酸等
②氮源：为微生物提供所需氮元素的营养物质。
如：N2、NH4NO3；尿素、氨基酸、牛肉膏、蛋白胨等
③无机盐：除C、H、O、N元素外微生物所需的其他元素
如：NaCl、KH2PO4、CaCl2、MgSO4等
4.其他条件：pH、特殊营养物质、O2的需求
如：培养乳酸杆菌，需要添加维生素；
培养霉菌，需要酸性环境；
培养细菌，需要中性或微碱性环境；
培养厌氧微生物，需要无氧条件。
（一）培养基的配置
制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
2.称量
3.溶化
4.灭菌
5.倒平板
1.计算
溶药品→煮溶琼脂
→定容→调pH
培养基、培养皿
灭菌
冷却到50℃左右，
在酒精灯火焰附近操作
根据培养基配方→计算配制所需各种成分用量
先调pH。如果灭菌后再调pH，可能造成污染。
强 调
1.制备培养基时，溶化完所有药品，应该先灭菌还是先调节pH？
2.培养基灭菌后，为什么要冷却到50 ℃左右时才倒平板。
你用什么办法来估计培养基的温度？
①温度过高，烫手且易损坏培养皿；温度过低，培养基开始凝固了。
②用手背估计，以刚刚不烫手为宜。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中水分过快的挥发。
1.目的：①防止杂菌污染。
②避免操作者自身被微生物感染。
（二）无菌技术
2.方法：
消毒：使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部的
一部分微生物。
灭菌：使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
3.主要包括：
①操作空间，操作者的衣服和手进行清洁和消毒
②微生物培养器皿，接种用具和培养基进行灭菌
③应该避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触
④微生物实验操作过程应该在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行
1.概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，
获得纯培养物的过程就是纯培养。
（三）微生物的纯培养
2.步骤：配置培养基、灭菌、接种、分离和培养等。
定义：分散的微生物在适宜的固体培养基 表面或内部可以繁殖形成肉眼可见、 有一定形态结构的子细胞群体。
特征：大小、形状、隆起程度、颜色、 边缘形态等。
应用：可以作为菌种鉴定的重要依据。
菌落
单菌落
①
②
③
④
⑤
酵母菌的纯培养
1.制备培养基
2.接种和分离酵母菌
3.培养酵母菌
配制培养基、
灭菌、倒平板
接种后的平板和未接种的平板倒置，
28℃左右恒温培养24-48h
⑥
平板划线法
接种环温度过高时就划线，可能杀死平板上的酵母菌。
逐步稀释平板上的酵母菌，以期最后能得到单独的菌落。
实验目的是要逐步稀释酵母菌，若最后划的线与第一区域相连，第一区域的酵母菌可能转移到最后一区域，导致稀释失败。
1.灼烧接种环后，为什么要等其冷却后再进行划线？
2.从第二次划线开始，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
3.为什么最后一区域的划线不能与第一区域相连？
注 意
①第一步划线前要灼烧是为避免接种环可能带上杂菌， 影响对酵母菌的纯化。
②之后每次划线前都灼烧，是为保证接种环无菌，每次 的划线都是对上一次的稀释。
③操作结束后仍要灼烧，对接种环进行灭菌，以防微生物 对环境的污染。
4.为什么在操作的第一步以及每次划线前都要灼烧接种环？
划线操作结束时，还需要灼烧接种环么？
5.如果最终在平板上划出五个区域，
整个过程需对接种环进行几次灼烧？
6次。
注 意
二、微生物的选择培养和计数
1.概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长， 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
（一）选择培养基
2.微生物筛选原理：人为提供有利于目的菌生长的条件
（包括营养、温度和pH等），
同时抑制或阻止其他微生物的生长
尿素【CO(NH2)2】含氮量高，是重要氮肥。施入土壤后，会被土壤中的某些细菌（产生脲酶催化）分解成NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
9mL无菌水
①铲取土样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
稀释涂布平板法的操作过程
1mL
90mL无菌水
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
（二）微生物的选择培养
稀释涂布平板法
③取0.1mL菌液，
滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
⑦待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，30-37℃恒温培养1-2天，可观察到单菌落。
稀释涂布平板法的操作过程
微量 移液器
①稀释要准确；
②加到培养基表面的菌液应严格定量；
③涂布要均匀，尽可能让菌种分散开；
④要有重复实验：同一稀释度应有至少3组重复，计数时 取其平均值，减少误差。
⑤要有空白对照：留一无操作的培养基，与接种的培养基 一同培养。
注 意
稀释涂布平板法可以较准确的计算菌液浓度，为了保证结果的准确性，应保证操作的严谨性：
（三）微生物的数量测定
1.方法：
（1）稀释涂布平板法：
一般选择菌落数为30-300的平板进行计数；
同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。
统计菌落数比活菌实际数目少：因为当两个或多个细胞连在一起时， 平板上观察到的只是一个菌落。
（2）显微镜直接计数：
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，
然后计算。
统计结果一般比活菌数目大：统计结果为活菌数和死菌数的总和。
每克样品菌株数=（菌落数/液体体积）*稀释倍数
微生物纯培养
平板划线法
稀释涂布平板法
显微镜直接计数
微生物的数量测定

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