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(共34张PPT)
2.2动物细胞工程
二、动物细胞融合技术与单克隆抗体
什么是动物细胞融合技术？
单克隆抗体是如何制备的 在临床上有哪些应用？
本节聚焦
1
2
A细胞
B细胞
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
高Ca2+ —高pH融合法等
脱分化
再分化
移栽
植物细胞融合
植物组织培养
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
移栽后的植株
植物体细胞杂交技术
植物体细胞杂交技术的优势：
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育出新的作物类型。　　　　
回顾旧知
实验：人——鼠细胞荧光标记融合实验
融合细胞
细胞
融合
37℃
40min
正在融合的细胞
红色荧光染料标记膜蛋白
绿色荧光染料标记膜蛋白
人细胞
小鼠细胞
有没有技术能让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？　
回顾旧知
1.概念：
2.原理：
3.融合方法：
4.意义：
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
细胞膜的流动性
PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。
（化学法、 物理法、 生物法 ）
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
动物细胞融合特有
杂交细胞：具有原来两个或多个细胞的遗传信息
01
动物细胞融合技术
与诱导植物原生质体融合的方法一样：P37
单核
灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，
但并不破坏它们的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是：
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生
作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞融合实质及完成的标志：细胞核的融合
相关信息
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。注意说明
动物细胞融合与受精作用的区别
（1）受精作用：是在同种生物之间进行的，精子与卵细胞的融合不需要任何诱导剂，受精卵内具备同种生物的两个亲本的遗传物质。
（2）动物细胞融合可在不同物种间进行，由于物种间存在生殖隔离，所以自然条件下不能融合成杂交细胞，必须有诱导剂才能融合。形成的杂交细胞具备两个亲本细胞的遗传物质，从而体现两个亲本的遗传特性。
植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞物理法：电融合法、离心法；化学法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较1.抗体是什么？由什么细胞分泌产生？早期获得抗体的方法及该方法的缺点
2.在体外培养条件下，如何让一个B淋巴细胞无限增殖
3.给小鼠注射特定抗原的目的是什么？哪里收集B细胞？
4.从小鼠体内提取的B淋巴细胞只有一种吗？为什么？
5.诱导融合后有多少类杂交细胞（只考虑两两融合）？
6.两次筛选的目的和手段分别是什么？
7.如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？
单克隆抗体的制备
二
自主学习P48-P49，小组讨论，解决下列问题：
2.早期获得抗体的方法
向动物体内反复注射某种抗原
→从动物血清中分离所需抗体
产量低、纯度低、特异性差
缺点：
抗原
反复注射动物
从动物的血清中分离抗体
单克隆抗体的制备
二
1.抗体的本质是什么？如何产生的？
浆细胞
抗体(蛋白质）
抗原
B细胞
激活
增殖、分化
若要得到大量的单一抗体，我们该如何去做？
3.制造单克隆抗体
理论基础：
每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。
B淋巴细胞不能无限增殖
克隆单一的B淋巴细胞，得到的细胞群就能分泌出化学性质单一、特异性强的抗体
制备思路：
困难：
单克隆抗体的制备
二
克隆
单克隆抗体
一个已免疫的
B淋巴细胞
体外培养，不能无限增殖
化学性质单一、
特异性强
分泌
英国
米尔斯坦
德国
科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
大胆设想：
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
（能产生抗体）
（能大量增殖）
杂交细胞
（既能大量增殖，又能产生特定抗体）
单克隆抗体的制备
二
单克隆抗体制备的过程：
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
从脾中提取
B淋巴细胞
多种
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
①不产生抗体的B细胞：
B细胞和记忆B细胞
②产生B1、B2、B3等不同抗体的B细胞(浆细胞)
目的： 获得能产生相应抗体的B淋巴细胞
融合体系中有多少种类型的细胞？
未融合的细胞
B淋巴细胞相互融合的细胞
骨髓瘤细胞相互融合的细胞
杂交瘤细胞
√
单克隆抗体制备的过程：
多种杂交细胞
未融合的细胞
瘤-瘤、
B-B、
第一次筛选：
用特定的选择培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
第二次筛选：
克隆化培养、抗体检测
（多次筛选）
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞（每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞）
克隆化培养
获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞
分泌的抗体能与特定抗原结合
瘤-记B、瘤-B1、瘤-B2、瘤-B3…
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
从细胞培养液中提取
从小鼠腹水中提取
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
单克隆抗体制备的过程：
单克隆抗体的优点：
特异性强、灵敏度高、可大量制备
单个杂交瘤细胞增殖产生高度纯一的抗体
2.制备过程
.&1& .
（二）单克隆抗体及其应用
3.制备单克隆抗体的过程：
动物细胞融合（原理：细胞膜的流动性）
*不是为了得到抗体！
第一次筛选：获得杂交瘤细胞
动物细胞培养（原理：细胞增殖）
第二次筛选：获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞
杂交瘤细胞的特点:
优点：能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
应用到的技术：
原理：
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
多种杂交细胞及未融合的细胞
诱导 融合
小鼠骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
给小鼠注射特定抗原
提取
杂交瘤细胞
第一次筛选
用特定的选择性培养基
第二次筛选
足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔
大量单克隆抗体
克隆化培养、抗体检测
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（产生抗体）
（能无限增殖）
从腹腔液中提取
从培养液中提取
（可进行多次）
动物细胞融合
动物细胞培养
归纳
向小鼠注射特定的抗原
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
第一次筛选：选择培养基
第二次筛选：克隆化培养 + 专一抗体检测
注射到小鼠
腹腔内增殖
体外培养
单克隆抗体
融合
★单克隆抗体制备的过程
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（特异性强、灵敏度高、可大量制备）
第一次筛选 第二次筛选
原因
方法
原理
结果
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用特定的选择培养基进行筛选
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
获得杂交瘤细胞
获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞
两次筛选的比较
只有融合的杂交瘤细胞可以生长，其他细胞死亡
细胞增殖、抗原抗体特异性结合
第一次筛选的杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，
通常用“有限稀释法”来进一步选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔培养板培养细胞，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下，开始培养，让其增殖。
然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。
“第二次筛选”原理
知识延伸
克隆化培养
抗体检测
稀释
单个细胞克隆化培养
专一抗体检验呈阳性的细胞
筛选原因：由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选获得的杂交瘤细胞中存在产生其他抗体的细胞。
原理：抗原——抗体特异性结合
【原理】将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞，培养之后(即克隆化培养)，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）。
第二次筛选
（1）筛选原因：由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选获得的杂交瘤细胞中存在产生其他抗体的细胞。
（2）筛选方法：用多孔培养皿培养，在每个孔内只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群。
（3）筛选目的：得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞
多孔培养板
克隆化培养和抗体检测
筛选抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖
又能产生特异性抗体
注意说明
阳性孔
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）
一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔
多孔细胞培养板
抗体检测板
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
“第二次筛选”原理
知识延伸
思考·讨论 单克隆抗体的应用
资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
①作为诊断试剂——最广泛应用
思考·讨论 单克隆抗体的应用
讨论：
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。
抗体：靶向运输药物，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。
药物：发挥治疗效应，如杀伤靶细胞
ADC
(2)用于运载药物
思考·讨论 单克隆抗体的应用
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
①检测的特异性和灵敏度大大提高；有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点
单克隆抗体的应用
三
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
1.单克隆抗体的优点：
2.单克隆抗体的应用
（1）广泛用作诊断试剂
实例：
（2）运载药物：
如ADC（抗体 - 接头 - 药物）
（3）用于治疗疾病。
特异性强，灵敏度高，并可能大量制备。
练习与应用
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
C
A
二、拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题 解决这些问题的大致思路是怎样的 这样做会有什么风险 请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
提示：可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。
练习与应用

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