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第九章 吸光光度法
第一节 显色反应与吸光光度分析条件的选择
无色透明的溶液吸光度大吗？
那如何测量其吸光度呢？
将待测组分与化学试剂作用生成有色化合物的反应叫显色反应。所用试剂称显色剂。
显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，其中绝大多数是配位反应。
一、显色反应
显色反应必须具备的条件：
1.灵敏度高。选择ε较大的显色反应。
2.选择性好。显色剂只与被测组分反应。
3.生成的有色物组成固定。
如：Fe3+ + 磺基水杨酸 → 三磺基水杨酸铁(黄色)
（组成固定）
Fe3+ + SCN - → [FeSCN]2+、 [Fe(SCN)2] + ……
（组成不固定）
4.若显色剂有颜色，则要求生成的有色化合物与显色剂之
间的颜色差别要大。λmax之差＞60nm。
5.显色过程要易于控制。
二、分光光度法分析条件的选择
（545nm）
1.入射光波长的选择。（最大吸收，最小干扰）
(1) 试样、试剂、显色剂都无色时，用纯水作参比。
(2) 试样无色，试剂、显色剂有色，采用不加试样的空白溶液作参比。（试剂空白）
(3)试样有吸收，而显色剂等无色，可采用不加显色剂的试样为参比。（试样空白）
(4)均有色，有吸收，对试样加入掩蔽剂，褪色后再加显色剂等作为参比。(褪色空白)
2.参比溶液的选择
参比溶液是用来调节仪器工作零点的溶液。
3.吸光度测量范围的选择
吸光光度分析中较适宜的吸光度范围为A=0.2-0.8（T=15%-65%),此时,测量结果的相对误差Er<4%。吸光光度测量最好选吸光度读数在分光光度计刻度尺的中间而不要落在标尺的两端。透光度T很小或很大时,
测量误差都很大，应通过控制标准溶液、被测试液的浓度和选择比色皿的厚度,使吸光度在0.2-0.8范围内。
先配制一系列标准溶液，在最大吸收波长处，测出它们的吸光度，作图，同条件下测未知液的吸光度，从图中查出未知液的浓度。
c
A
工作曲线图
Ax
cx
c1 c2 c3 c4 c5
A1 A2 A3 A4 A5
1.标准曲线法
第二节 吸光光度法的定量测定方法及其应用
同条件下分别测定未知液与标准溶液的吸光度Ax和
A标，根据朗伯-比尔定律，应有式：
2.比较法
因为：
所以：
3.标准加入法
A瓶：
加入待测液浓度为cx,
B瓶：
加入等量待测液浓度为cx,再加入标准液浓度为c0
A瓶吸光度为Ax B瓶吸光度为A0
可求得：
二、吸光光度法的应用-钼蓝分光光度法测磷
1.原理：
PO43- + 12MoO42- + 24H+ = H3[P(Mo3O10)4]+12H2O
磷钼杂多酸（黄色）
H3[P(Mo3O10)4]+SnCl2+2HCl=H3PO4 10MoO3 Mo2O5
磷钼蓝（蓝色）
+SnCl4+H2O
磷钼蓝的最大吸收波长 λmax=695nm
2.实验步骤：
（1）配置含PO43- 5ug/mL的标准溶液
(2) 取25毫升的比色管三支，洗净编号为 ①②③
(3) 向②③号管中加入标准溶液、待测液各10mL。
向①②③加入蒸馏水5mL、钼酸铵-硫酸混合液1.5mL、摇匀，再加入SnCl2-甘油溶液2滴，摇匀。加蒸馏水至25.00mL。摇匀，静置10~12min。
比色管
(4)用722型分光光度计以①为参比溶液分别测②③号溶液的吸光度A标、A测。
比色皿
3.数据记录与处理
编号 磷的含量ug/mL 吸光度
①参比液 0 0
②标准液 5 0.649
③待测液 x 0.475
数据记录表
计算，得：
第五节 分光光度计
分光光度计通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光。波长可调, 故选择性好, 准确度高。
光源
单色器
吸收池
检测器
一、分光光度计的基本部件：
信号显示系统
1. 光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320 ～ 2500 nm)
紫外区：氢灯，氘灯(180 ～ 375 nm)
2.单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。（棱镜 光栅 ）
玻璃350 ～ 3200 nm, 石英185 ～ 4000 nm
3.吸收池(比色皿):用于盛待测液及参比溶液。
玻璃 — 能吸收UV光，仅适用于可见光区
石英 — 不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区
要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）
4. 检测器：是把光信号转化为电信号的装置，由光电管和指示器组成。
5.信号显示系统 是将检测器产生的电信号放大并在数字显示屏上显示参数：透射比、吸光度、浓度、斜率。
二、分光光度计的工作原理
——内部光的传播途径
三、分光光度计的使用方法（722型）
（1）开机预热20min。
（2）波长调整。
（3）将盛有标准溶液、待测液、空白溶液的比色皿及遮光体放入样品架，合上样品室盖。
（4）调0%T:按功能键，调至T模式，拉动样品架拉杆使遮光体正对着光路，然后按动0%T键，使显示器显示000.0。
（5）调100%T(0A):在T模式下，拉动样品架拉杆使盛有空白溶液的比色皿正对着光路,然后按动100%T键，使显示器显示100.0。然后按功能键，调至A模式,此时显示器显示数值应为000.0，若不是，则按住0%键，使数值为000.0。
（6）A模式下，推或拉动样品架拉杆将标准溶液、被测试液依次置入光路，分别读取并记录吸光度数值。
（7）取出比色皿，倒掉残液，清洗比色皿。
（8）关闭电源。
比色皿使用要点：（1）拿比色皿时，用手捏住比色皿的磨砂面，切勿触及透光面，以免透光面被玷污或磨损。（2）被测液以倒至比色皿的约3/4高度处为宜。（3）在测定一系列溶液的吸光度时，通常都是按从稀到浓的顺序进行。使用的比色皿必须先用欲测溶液润洗2～3次。（4）比色皿外壁的液体用吸水纸吸干。（5）清洗比色皿时，一般用水冲洗。不能用碱液或强氧化性洗涤液清洗，也不能用毛刷刷洗，以免损伤比色皿。
思考题
有一高锰酸钾溶液浓度为c,盛于1cm
厚的比色皿中，测得透光率为50%；如果浓度为2c,其他条件不变，吸光度为多少？

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