资源简介

(共27张PPT)
3.1重组DNA技术的基本工具
目录/CONTENTS
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
01
DNA连接酶——“分子缝合针”
02
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
03
探究实践：DNA的粗提取与鉴定
04
01
课堂导入
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。
普通棉花
如何能培育出自身就能抵抗虫害 的棉花新品种呢？
转基因抗虫棉
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因 转入普通棉花
棉花细胞
普通棉花
(无抗虫特征)
(含抗虫基因)
棉花植株
(有抗虫特征)
基因工程
抗虫基因
提取
课堂导入
01
01
基因工程
　　指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
【归纳定义】工程别名：
操作对象：
操作水平：
工程实质：
重组DNA技术
基因
DNA分子水平
基因重组
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
Part 01
01
限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀”
1.来源：
主要是原核生物
简称限制酶
2.种类：
数千种
注意：限制酶不是一种酶，而是一类酶。
3.功能：
能够识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
为什么限制酶不切割原核生物本身的DNA分子？
特点：专一性
“两个特定”
原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用。
01
　
黏性末端　　　　
黏性末端
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
EcoRI限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开
*形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____
*一个限制酶切割一次形成___个黏性末端
*同一种限制酶切割形成的黏性末端____
*两个黏性末端有___个游离的磷酸基团。
AATT
两
相同
2
实例
SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开
中轴线
在G与C之间切割
01
实例
实例
平末端　　　平末端
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口叫平末端。
01
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
T G A A T T C G
A C T T A A G C
A G A A T T C T
T C T T A A G A
缺口怎么办
DNA连接酶——“分子缝合针”
Part 02
02
DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用：
2.种类：
（1）E.coli DNA连接酶
来源于大肠杆菌，只连接黏性末端
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来。
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
磷酸二酯键
02
DNA连接酶——“分子缝合针”
2.种类：
（2）T4 DNA连接酶
来源于T4噬菌体，既能连接黏性末端，又能连接平末端（但连接平末端的效率相对较低）。
*基因工程中通常形成黏性末端
02
几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
DNA聚合酶的作用
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
02
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
Part 03
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
1.作用：
动植物病毒
噬菌体
2.种类：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
03
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
大肠杆菌及质粒结构模式图
3.载体需具备的条件
（2）能够在受体细胞中复制并表达
（3）有某些标记基因
（4）对受体细胞无害.
或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
供外源DNA片段中的基因插入其中
便于鉴定和筛选
（1）有一个至多个限制酶切点
03
探究实践：DNA的粗提取与鉴定
Part 04
探究实践：DNA的粗提取与鉴定
1.提取DNA的原理
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
如：(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
(2)DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
2.鉴定DNA的原理
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
实验原理
04
探究实践：DNA的粗提取与鉴定
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
材料用具
1.选材：
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
二苯胺试剂要现配现用，用棕色瓶保存。
04
探究实践：DNA的粗提取与鉴定
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
2.去除杂质——
3.DNA的析出——
1.破碎细胞——
洋葱
研磨液
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
方法步骤
思考：如何评价结果？
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
04
习题练习
1.下列对DNA连接酶的功能描述正确的是( )
A.将碱基、脱氧核糖、磷酸连接起来
B.在基因工程中只作用于两个黏性末端
C.与DNA聚合酶作用的部位相同，作用对象不同
D.用于DNA复制时母链与子链间形成氢键
答案：C
解析： DNA连接酶的作用是在相邻两个核苷酸的磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，A、D错误；DNA连接酶在基因工程中作用于两个黏性末端或两个平末端，B错误；DNA连接酶与DNA聚合酶作用的部位相同，均在磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，作用对象不同，DNA连接酶作用于DNA片段，DNA聚合酶作用于单个游离的脱氧核苷酸，C正确。
05
习题练习
2.下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是( )
A.用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B.限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性内切核酸酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接
D.只有用相同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
答案：B
解析： 用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，又因DNA为双链结构，因此要断裂4个磷酸二酯键，即被水解的磷酸二酯键有4个，A错误；限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，B正确；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性核酸内切酶切出的黏性末端不同，分别为—CATG和—CTAG，因此不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，则也能形成重组质粒，D错误。
05
习题练习
3.将外源基因送入细胞通常是利用质粒作为载体。下列有关质粒的叙述，正确的是( )
A.质粒是一种裸露的、结构简单的环状双链DNA分子
B.质粒从细胞中提取出来后可以直接使用，无须人工改造
C.质粒是具有自我复制能力的DNA分子，只存在于原核生物中
D.质粒一般分子量大，便于携带特殊基因片段
答案：A
解析：质粒是一种裸露的、结构简单的环状双链DNA分子，独立于原核细胞拟核DNA和真核细胞细胞核DNA之外，A正确，C错误；在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，B错误；质粒一般分子量小，便于携带DNA片段进入受体细胞，D错误。
05
课堂小结
06
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源 ：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来

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