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第８章　新陈代谢总论与生物氧化
8.1　新陈代谢总论
8.2　生物氧化
8.3　生物氧化的系统
8.4　氧化磷酸化
8.5　线粒体外ＮＡＤＨ的跨膜转运
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8.1　新陈代谢总论
8.1.1　新陈代谢的研究方法
新陈代谢的过程有上千种化学反应,这些非常复杂,相互联系,那么在代谢过程中究竟有哪些中间产物产生,又是通过什么机制转变成下一个产物的 这些代谢过程又是如何研究出来的呢 下面简要介绍几种最常用的研究方法.
１.活体内与活体外实验
(１)活体内实验
又称为整体实验,是指用整体生物材料或高等动物离体器官或微生物细胞群体进行中间代谢实验研究,文献中用拉丁文“invivo”表示.
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8.1　新陈代谢总论
活体内实验的优点是其实验结果代表生物体在正常生理条件下,在神经、体液等调节机制下的整体代谢情况,这种结果比较接近生物体的实际.如利用代谢障碍病的人或动物进行代谢研究:由于患者体内某物质的代谢受到阻碍,往往会引起某些中间代谢物的大量积累或排出.此研究方法应用的典型例子是１９０４年德国化学家Knop提出的脂肪酸β-氧化学说(见脂的代谢).
活体内实验跃然优点明显,但缺点也不少,如生物体内非常复杂,相互之间又互相联系与沟通,有时很难进行很精细的定位研究;另外,在完整生物体内进行实验研究就会有个体数量、大小、生活周期、伦理道德等的一些问题的限制,因而又常用活体外实验研究代谢.
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8.1　新陈代谢总论
(２)活体外实验
活体外实验是指用从生物体分离出来的组织切片、组织匀浆或体外培养的细胞、细胞器及细胞抽提物进行中间代谢实验研究,用“invitro”表示.与活体内实验相比,其优点是可同时进行多个样本,或进行多次重复实验,实验结果也比较接近生物体内正常生理条件下的实验的结果.利用该方法的典型例子———糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化等;反应过程均从活体外实验得到了证据.
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8.1　新陈代谢总论
２. 同位素示踪法
同位素是原子序数相同但相对原子质量不同的元素,其在元素周期表中占有相同的位置.因此,用同位素标记的化合物与非标记物的化学性质、生理功能及在体内的代谢途径完全相同,故而,利用同位素“标记”追踪代谢过程中被标记的中间代谢产物、产物及标记元素所在的位置,即可获取丰富的代谢资料.
同位素示踪技术是研究代谢过程的最有效的方法.例如,将１４C标记在乙酸的羧基上,然后饲喂动物,在动物呼出的CO２中发现了１４C,则说明乙酸的羧基在动物体内转变成了CO２.再如,用同位素过示踪法阐明了胆固醇分子中的碳原子是来源于乙酰辅酶A.同位素分稳定性同位素和放射性同位素两类.二者的区别是是否有衰变和射线辐射,
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8.1　新陈代谢总论
３.代谢途径阻断法
正常生物体的中间代谢过程中,中间产物很快进入下一步反应而被消耗,若用适当方法(如利用抗代谢物或酶的抑制剂)造成中间代谢的某一环节障碍,阻断代谢途径,则中间产物积累,进行分析研究后可获得中间产物的资料.如果用不同的抑制剂来进行综合研究,则可得各步反应的底物与产物的关系,从而构建出完整的代谢途径.如Krebs首先观察到丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶,从而导致细胞内琥珀酸积累,为其最终确定二羧酸循环途径提供了重要的依据.
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8.1　新陈代谢总论
４.突变体研究法
也指代谢缺陷型突变体研究法,如采取诱变剂使微生物的基因发生突变,从而造成某种酶缺损,代谢途径中断,缺损酶前面的中间产物会大量积累.测定这些中间代谢物,有助于分析鉴别特异的酶,从而阐明有关的代谢途径.利用微生物的遗传突变型研究新陈代谢机制,比利用其他生物有以下优越性:容易突变、经济、简便等.
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8.1　新陈代谢总论
５.核磁共振波谱法
核磁共振波谱法是利用分子内处于不同环境中的原子核的化学位移原理,不破坏机体的整体结构,对分子无损伤,不需做预处理和纯化,在分子、原子水平上检测生活状态下机体特定部件的物质特性,并可检测化学变化、构象变化等动力学过程.该方法的技术需要２０世纪６０年代末由RichardErnst建立的高分辨率的核磁共振波谱(NMR)技术的支持.
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8.1　新陈代谢总论
8.1.2　生物体内能量代谢的基本规律
生物体中新陈代谢的研究中,除了物质的转变以外,还伴随着能量变化,称为能量代谢.生物体内能量代谢也遵循热力学定律,因此需要了解热力学的基本概念和基本原理,以助于理解具体的代谢反应过程能否发生、物质转化与能量转移等内容.
8.1.3　高能化合物与ATP
在生化反应中,某些含自由能特别多的化合物,即随水解反应或基团转移反应可放出大量自由能(＞２１kJ/mol)的化合物,称为高能化合物.高能化合物一般对酸、碱和热不稳定.在生物体中常见的是高能磷酸化合物.
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8.1　新陈代谢总论
１. 高能化合物的类型
生物体中常见的高能化合物,根据有无与磷酸基团相偶联,可以分为高能磷酸化合物及非磷酸高能化合物.高能磷酸化合物是指微生物体中存在的各种含自由能高的磷酸化合物,其在水解时,每摩尔化合物释放的自由能高达３０~６０kJ/mol,水解时放出大量自由能的键常称为高能磷酸键,这与化学中的键能(断裂一个化学键需要的能量)的含义完全不同.高能磷酸化合物常用~P或~○P来表示.
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8.1　新陈代谢总论
8.1.4　磷酸肌酸的贮能作用
在高能磷酸化合物中,最直接的贮能化合物是磷酸肌酸(creatinephosphate),它在人类大脑中的含量是ATP的１ ５倍,在肌肉中含量是ATP的４倍.磷酸肌酸能够在高耗能时很快将高能磷酸基团转移给ADP生成ATP.如在肌肉紧张活动时,磷酸肌酸可以将ATP的恒定水平维持４~６s,在肌肉恢复期,肌酸又用其他来源的ATP再合成磷酸肌酸.催化磷酸肌酸转移高能磷酸基团的酶是肌酸激酶,反应式如下:
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8.1　新陈代谢总论
8.1.5　辅酶A 的递能作用
辅酶A (coenzymeA)作为酰基的载体可以参与许多代谢过程,其中一个就是以形成酰基CoA 的形式参与代谢过程,特别是乙酰CoA.乙酰CoA 是由乙酰基与CoA 通过一个硫酯键结合形成的,乙酰CoA 上的硫酯键与ATP的高能磷酸键相似,在水解时可释放出３１.３８kJ/mol的自由能,因此也属于高能化合物.乙酰CoA 可参与许多代谢过程,在糖类脂类代谢过程中起到关键枢纽的作用(详细内容在糖的代谢与脂的代谢中介绍).
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８.２　生物氧化
8.2.1　生物氧化的特点
生物氧化与非生物氧化(体外燃烧)的化学本质是一样的,都是电子得失的过程,最终都产生CO２和H２O,且所释放的能量也相等,但二者进行的方式和过程却有很大的区别,与体外燃烧相比,生物氧化有以下特点:
① 生物氧是在体温(３７℃)、近于中性的含水环境中由酶催化来完成.
② 在酶等的催化作用下,能量逐步释放并以ATP形式捕获能量,从而保证了机体不会因能量骤然大量释放而损伤机体,同时又可提高释放能量的有效利用率.
③ 生物氧化中CO２是有机酸脱羧生成的.根据脱羧基的位置不同,又可分为α-脱羧和β-脱羧.
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８.２　生物氧化
④ 生物氧化中代谢物上经脱氢酶激活脱落下来的氢经过一系列的传递体传递后与氧结合而生成水.
⑤ 生物氧化有严格的细胞定位,分为线粒体氧化体系(真核生物)和非线粒体氧化体系(原核生物在细胞膜上进行).
8.2.2 生物氧化的方式
生物氧化的方式有失电子氧化、脱氢氧化、加氧氧化和加水脱氢氧化等方式.
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８.２　生物氧化
１.失电子氧化
生物氧化通过电子的得失来实现,如细胞色素b和细胞色素c１之间的电子传递.
２. 脱氢氧化
如苹果酸脱氢生成草酰乙酸:
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８.２　生物氧化
３.加氧氧化
有机物直接加氧,如脂肪酸在单加氧酶的催化下直接加氧生成α-羟脂酸:
４.加水脱氢氧化
加水的同时伴有脱氢进行氧化,如延胡索酸加水后脱氢氧化为草酰乙酸:
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８.２　生物氧化
8.2.3　生物氧化的产物
生物氧化的主要产物就是CO２和H２O,同时释放的能量被ADP捕获,生成ATP,先主要介绍一下CO２和H２O 在生物体中是如何产生的.
１.生物氧化中二氧化碳的生成
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８.２　生物氧化
生物氧化中二氧化碳是由糖、脂、蛋白质等有机物转变为含羧基化合物后,由脱羧作用产生的.根据脱羧反应的性质,可分为直接脱羧和氧化脱羧两大类,根据脱去的羧基在有机分子中的位置,每一类又可区分为α-脱羧和β-脱羧两类.
２. 生物氧化中水的生成
生物氧化过程中水的生成大致可分为两种方式:直接由底物脱水和通过呼吸链生成水.其中动物体内的水主要是由呼吸链生成.
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8.3　生物氧化的系统
8.3.1　呼吸链的组成
两类典型呼吸链由线粒体内膜上几个蛋白质复合物组成:NADH 脱氢酶复合物(也称NADH-CoQ 还原酶或复合物Ⅰ)、细胞色素bc１ 复合物(也称CoQ-Cytc还原酶或复合物Ⅲ)、细胞色素氧化酶(也称复合物Ⅳ)及琥珀酸-CoQ 还原酶复合物(也称复合物Ⅱ).各复合物呼吸链中的顺序如图８-４所示.
呼吸链由许多个组分组成,参加呼吸链的氧化还原酶可分为烟酰胺脱氢酶类、黄素脱氢酶类、铁硫蛋白类、细胞色素类、辅酶Q 类五类.
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8.3　生物氧化的系统
8.3.2　呼吸链的电子传递
呼吸链中氢和电子的传递有严格的顺序和方向,这些顺序和方向是根据各种电子传递的标准氧化还原电位(E０′)的数值,并利用特异的抑制剂切断其中的电子流后,再测定电子传递链中各组分的氧化还原状态等实验而得到的结论.
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８.４　氧化磷酸化
8.4.1　氧化磷酸化的类型
根据生物氧化方式,可将氧化磷酸化分为底物水平磷酸化和电子传递体系磷酸化(植物体中还有光合磷酸化,在这里不作介绍).
１.底物水平磷酸化
底物水平磷酸化(substratelevelphosphorylation)是指直接由一个代谢中间产物(如高能磷酸化合物磷酸烯醇式丙酮酸)上的高能磷酸基团转移到ADP上而生成ATP的反应.其可用下式表示:
X~P＋ADP →XH＋AT
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８.４　氧化磷酸化
式中,X~P代表底物在氧化过程中形成的高能中间化合物.例如,在糖的分解代谢中:
底物水平磷酸化的作用特点就是在ATP形成时需氧的参与,故而在有氧或无氧的情况下均可进行,也不利用线粒体ATP酶的系统,所以这种方式生成ATP的速度较快,但量不多.
２.电子传递体系磷酸化
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８.４　氧化磷酸化
电子传递体系磷酸化也称为氧化磷酸化,是指电子由NADH 或FADH２经呼吸链传递给氧,最终在消水的过程中伴有ADP磷酸化生成ATP的过程.此磷酸化方式需要有氧的参与,需要利用线粒体ATP酶的系统产生ATP,这种方式是生物体产生ATP的最主要方式,生物体内约９５％的ATP是通过此种方式产生的.
8.4.2　电子传递与ATP的生成
呼吸链与ATP生成量有重要关系,在电子传递过程中氧化释放的能量与ATP合酶共同作用促使磷酸和ADP生成ATP.呼吸链的复合物和ATP合酶均嵌合在线粒体内膜上,
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８.４　氧化磷酸化
在NADH 呼吸链中通过复合物Ⅰ、复合物Ⅲ和复合物Ⅳ传递电子,并将质子泵出内膜,释放的能量较多,通过自由能的变化计算其释放的能量分别是70.44kJ/mol、３８.６０kJ/mol和１００.３５kJ/mol.合成１molATP所需的能量为３０.５２kJ,这三个部位所产生的能量均超过合成ATP所需要的能量.而FADH２呼吸链中,只有复合物Ⅲ和复合物Ⅳ通过传递释放的能量超过合成ATP所需要的能量.并且两种典型呼吸链上共有三处释放能量比较多的地方,这三个地方也是传递链上被特异性抑制剂切断的地方,且在该处电位有较大的“跳动”,基本在０.２V 以上.研究氧化磷酸化的最常用的方法是测定线粒体或其制剂进行氧化时的P/O 值.
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８.４　氧化磷酸化
P/O 值是指每消耗１mol氧所消耗无机磷酸的物质的量.根据所消耗的无机磷酸的物质的量可间接测出ATP生成量.已经用实验确定了NADH 和FADH２的P/O 分别是２.５和１.５,所以由此推算脱下来的氢质子经NADH 和FADH２呼吸链的传递生成１mol水后生成的ATP数量分别是２.５mol和１.５mol.
8.4.3　氧化磷酸化的机制
关于氧化磷酸化产生ATP 的作用机制,主要有三个学说:化学偶联学说(chemicalcouplinghypothesis)、构象变化学说(conformationalcouplinghypothesis)和化学渗透学说(chemiosmotichypothesis).
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８.４　氧化磷酸化
8.4.4　氧化磷酸化的抑制
氧化磷酸化受某些化学试剂的影响,根据影响方式的不同,可分为以下４类.
１. 电子传递抑制剂
２.解偶联剂
３.离子载体抑制剂
４.氧化磷酸化抑制剂
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８.５　线粒体外NADH 的跨膜转运
8.5.1　甘油-α-磷酸穿梭系统
细胞质基质中有甘油-α-磷酸脱氢酶,可以将磷酸二羟丙酮还原,生成甘油-α-磷酸.甘油-α-磷酸可以自由扩散进入线粒体内膜.进入后,在线粒体内的甘油-α-磷酸脱氢酶的作用下催化甘油--磷酸脱氢,从而将氢交给FAD,生成FADH２后进入FADH２呼吸链,最终生成１分子水和１.５分子ATP (图８-９).简单地说,穿梭过程就是细胞质基质中的１分子的NADH 经过甘油-α-磷酸穿梭进入线粒体,将氢交到FADH２呼吸链而最终氧化为水,同时生成１.５分子ATP.
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８.５　线粒体外NADH 的跨膜转运
甘油ＧαＧ磷酸穿梭系统主要存在于肌肉和神经组织中,所以这些组织中的１分子葡萄糖彻底氧化分解后,产物比其他组织要少２分子,即只产生３０分子ATP (详见第９章).NADH 通过此穿梭系统带一对氢原子进入线粒体,由于经FADH２呼吸链进行氧化磷酸化,故只能产生1.5 (２)分子ATP.
8.5.2　苹果酸穿梭系统
细胞质基质中的NADH 还可以通过苹果酸穿梭作用来完成其氧化磷酸化.线粒体内外均有苹果酸脱氢酶,其辅酶都是NAD＋ .细胞质基质中的NADH 经过苹果酸脱氢酶催化而和草酰乙酸生成苹果酸,苹果酸可进入线粒体内膜,进入后在线粒体内的苹果酸脱氢酶的作用下重新生成NADH 而进入NADH 呼吸链氧化.
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８.５　线粒体外NADH 的跨膜转运
但同时生成的草酰乙酸不能直接返回细胞质基质,而需要线粒体内外的谷草转氨酶的作用返回细胞质基质).这种穿梭作用后,由于细胞质基质中的NADH 进入后,依然进入NADH呼吸链, 所以１ 分子的NADH 经过苹果酸穿梭系统后, 生成１ 分子水和２.５ 分子ATP.苹果酸穿梭系统存在于肝、肾、心等组织,在这些组织中,１分子葡萄糖彻底氧化分解共产生３２分子ATP (详见第９章).
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图８-４　典型呼吸链中各复合物
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图８-９　甘油-α-磷酸穿梭系统
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