资源简介

(共30张PPT)
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
温故知新：PCR扩增目的基因的过程
问题1:获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？
就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解
不能原因
那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？
第2节第2课时
第2节 基因工程的基本操作程序
目标
01
02
03
针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。（科学探究）
结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。（科学思维）
学习目标
运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等（生命观念）
基因表达载体的构建的目的？载体还需要哪些结构？各个元件有什么作用？
请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。
2
3
4
1
合作探究一：请同学们自主阅读教材P80，小组合作思考讨论完成问题。
目的基因插入什么位置？目的基因插入位点是随意的吗？
使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？如果不能，怎么改进？
1.目的：
①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代;
2.组成：
质粒
①启动子
基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA
②终止子：
限制酶切割位点
基因的尾端，能终止mRNA的转录
③标记基因
作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
④复制原点
⑤目的基因
②使目的基因能够表达和发挥作用
问题2: 目的基因该插入什么位置？
自我复制的起点
问题2:目的基因该插入什么位置？
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
2.组成：
Bt基因
（目的基因）
基因表达载体
复制原点
启动子
终止子
1.诱导型启动子
即在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类启动子的调控下大幅度地提升或降低。
诱导物
作用
诱导型启动子
激活或抑制
目的基因表达
如：光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。
启动子类型：
启动子类型：
2.组成型启动子
能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自于管家基因，可连续不断地启动基因的表达。
如：使Bt基因表达的启动子
如外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡；
3.组织特异性启动子
其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。
优点：启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果。
启动子与终止子位于DNA分子中，
作用：起始和终止转录过程。
启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，
作用：起始和终止翻译过程。
问题3: 辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”。
问题4: 请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。
2.组成：
3.基因表达载体构建的过程：
质粒
载体
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
限制酶切割位点
限制酶
在构建抗虫棉的基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口
用同种限制酶或
能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
DNA连接酶
重组
DNA分子
基因表达载体
（核心工作）
问题5: 使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？有何缺点？怎么改进？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
单酶切缺点：
①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接
如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
双酶切
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
如何使用标记基因筛选？
1.请结合下图，回答问题：
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
-GGGCCC-
-CCCGGG-
（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？如果能有何弊端？
能
①质粒、目的基因发生自身环化；
②质粒与目的基因会发生反向连接。
-GGGCCC-
-CCCGGG-
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
-GGGCCC-
-CCCGGG-
2.图甲、图乙分别表示质粒和外源DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是(　　)
A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用Sma Ⅰ切割
B.图甲所示的质粒分子在经Sma Ⅰ酶切割后含有4个游离的磷酸基团
C.为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶
D.用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和Bam HⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以
A
总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？各自适用于什么生物？
2
3
1
合作探究二：请同学们自主阅读教材P81，小组合作思考讨论完成问题。
农杆菌的特点？农杆菌转化法的原理。
请文字和箭头表示农杆菌转化法的过程。
受体细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
2.农杆菌转化法（常用）
1.花粉管通道法
我国科学家独创
1.显微注射法
2.病毒介导法
Ca2+处理法
3.基因枪法（常用）
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
目的基因
目的基因
适用生物：开花植物
1.目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（可转移的DNA）
1.目的基因导入植物细胞
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
②原理：
目的基因
Ti质粒
表
达
载
体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
③过程：
1.目的基因导入植物细胞
根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。
例如，可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
1.目的基因导入植物细胞
Ti质粒
T-DNA
（可转移的DNA）
目的基因
构建表达载体
含目的基因的
重组 Ti 质粒
转入农杆菌
含重组 Ti 质粒的农杆菌
导入植物细胞
将目的基因插入
染色体 DNA 中
第一次拼接
第二次拼接
第一次导入
第二次导入
该过程涉及两次拼接和两次导入，你能总结吗？
两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）。
2.目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
①体积大，易操作。②易表现出全能性。
（3) 过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
（2）病毒介导法
拓展延伸
科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
（1）常用方法：
Ca2+处理
原核细胞（常选择大肠杆菌）
目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
（2）受体细胞：
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
3.目的基因导入微生物细胞
Ca2+
感受态细胞
吸收
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
（1）Ca2+处理法
3.目的基因导入微生物细胞
3.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是
A.不必构建表达载体就可以直接导入
B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞
D.有时可以取代农杆菌转化法
D
A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ 是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
4.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是
B

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