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(共35张PPT)
普通棉花
转基因抗虫棉
苏云金杆菌
毒蛋白基因
毒蛋白
杀死害虫
第3章 基因工程
……CTACGATGAATTCC..........GTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCAT..........CTTAAGGGATT……
……CTACGATG
……GATGCTACTTAA
AATTCCCTAA……
GGGATT……
AATTCC..........GTAG
GGCAT........CTTAA
黏性末端
目的基因
EcoRI剪切目的基因
1.要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？
2.如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。
会产生相同的黏性(平)末端
将两个双链DNA片段“连接”起来的酶
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
1.概念：
2.作用：
3.种类：
（1）E.coli DNA连接酶
来源于大肠杆菌，只连接黏性末端
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来。
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
磷酸二酯键
E 考里
3.种类：
（2）T4 DNA连接酶
来源于T4噬菌体，既能连接黏性末端，又能连接平末端（但连接平末端的效率相对较低）。
*基因工程中通常形成黏性末端
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只能将具有互补 的DNA片段连接起来 “缝合”两种末端，但连接 的效率相对较低
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
大肠杆菌
T4 噬菌体
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
注意：DNA连接酶没有识别序列的特异性、只与末端类型有关
3.种类：
G
A
G
T
A
T
C
DNA
连接酶
DNA
连接酶
A
T
A
G
T
C
C
G
A
A
T
T
DNA连接酶：连接两个DNA片段
C
A
A
T
T
DNA
聚合酶
DNA聚合酶：以DNA的一条链作为模板，连接游离的脱氧核苷酸，形成磷酸二酯键。
思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？（72页）
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
以DNA的一条链为模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
3.根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
4.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(　　)
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
C
怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
什么是质粒？
1.载体的作用是什么？
2.有哪些种类？
3.常用的载体是哪种？其有什么特征？
4.作为载体应具备什么条件？
提示：①载体能与外源基因连接需具备什么条件？
②载体要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在需具备什么条件？
③我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
阅读教材P73，回答下列问题：
作为运载工具，将外源基因送入受体细胞
质粒、噬菌体和动植物病毒
质粒
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
1.作用：
动植物病毒
噬菌体
2.种类：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
动物病毒
噬菌体
03
大肠杆菌及质粒结构模式图
3、运载体需具备的条件
（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
（2）有一个至多个限制酶切点
（3）有某些标记基因，通常有：①抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)。②荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。
（4）对受体细胞无害、易分离
能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；
便于与不同目的基因结合
便于鉴定和筛选
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
知识拓展
标记基因通常有:
①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)
②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体携带目的基因导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
什么是质粒？
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
复制原点
(2)作用不同：
拟核DNA是细菌的主要遗传物质，包含细菌生命活动的遗传信息，没有了它细菌就无法存活、繁殖；质粒DNA是附加的遗传物质，使生物表达一些特殊的性状，如耐药性、特定物质的降解能力等，如果没有了质粒细菌依然可以正常生活、繁殖。
(1)分子量不同：
拟核DNA分子量较大：质粒DNA分子量较小。如大肠杆菌细胞内的质粒仅为拟核DNA分子的1%-2%。
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
取出
转移
通过本节的学习，现在你能描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉吗？
质粒
人的DNA分子
用EcoRⅠ限制酶切割
用EcoRⅠ限制酶切割
用DNA连接酶粘合
计划让大肠杆菌表达人类生长激素？
04
1.实验原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液
在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
04
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
1.选材：
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
2.材料用具
研磨液、二苯胺的配制方法
课本P117
04
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
2.去除杂质—
3.DNA的析出—
1.破碎细胞—
洋葱
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
研磨液
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
3.方法步骤
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
析出DNA
04
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
4.DNA的鉴定—
二苯胺
2mol/L的NaCl
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
思考：如何评价结果？
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
3.方法步骤
用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
2.材料用具
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。
SDS（十二烷基疏酸钠）
可使蛋白质变性与DNA分离
EDTA（乙二胺四乙酸）
DNA酶抑制剂，可防止细胞破碎后DNA降解DNA
Tris（三羟甲基氨基甲烷）
提供缓冲体系，使DNA在缓冲体系中呈稳定状态
研磨液
P117
3.方法步骤
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
3.方法步骤
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
3.方法步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；
3.方法步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
(1)搅拌时应轻缓、并沿一个方向
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
(2)酒精预冷的作用:
同“低温放置的作用”
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
3.方法步骤
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
P117
现配现用
易被空气氧化，颜色改变
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
3.方法步骤
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
4.结果分析与评价
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和__________________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，________________________________________________________。
目的基因
质粒上的抗生素抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。
目的基因与目的基因
质粒片段与质粒片段
反向连接

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