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第二课时 微生物的选择培养和计数
本节聚焦
怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？
如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？
测定微生物数量的常用方法有哪些？
情境问题：
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，某研究小组想在土壤样品中分离得到能分解尿素的细菌，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现，该怎么办呢？
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
思考：为什么要从热泉中筛选水生栖热菌呢？
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶被广泛应用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）
美国黄石国家公园
耐高温的酶
耐高温生物体
寻找
寻找
高温环境（热泉、火山口）
影印法转移到含青霉素培养基中培养（实验组）
完全培养基培养长出所有菌落
下列菌落中怎样选择出具有抗青霉素能力的细菌
举例1
影印法转移到不含青霉素培养基中培养（对照组）
实验组没有青霉素抗性的细菌被淘汰
具有青霉素抗性的菌落
启示：在培养基中添加青霉素选择出具有抗青霉素能力的细菌
类比1：将土壤稀释液中能分解纤维素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基,用纤维素作为唯一碳源,可以将分解纤维素的细菌分离出来
设计一种选择培养基,用石油作为唯一碳源,可以将分解石油的细菌分离出来
类比2：将土壤中能分解石油的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
总结：实验室中如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
一
选择培养基
选择培养基：
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。
不加氮源
分离自养微生物
分离酵母菌和霉菌
(青霉素能杀死细菌、放线菌)
分离固氮微生物
加入青霉素
加高浓度食盐
分离金黄色葡萄球菌
石油是唯一碳源
分离能消除石油污染的微生物
不加碳源
针对训练1：写出能筛选出下列微生物的选择培养基：
思考-讨论
尿素的立体结构
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
讨论1：如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
讨论2：该培养基与普通（完全）培养基有哪些共同点和不同点？
设计一种选择培养基，培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能利用尿素在该培养基上生长繁殖，而其他微生物由于缺乏氮源而受抑制。
细菌利用尿素的原因：
能合成脲酶。
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
一
选择培养基
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一（普通）
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二（筛选能分解尿素的细菌）
2.从用途上来讲，培养基二属于 培养基，目的是为了获得 。
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是________________。
固体
添加了凝固剂琼脂
选择
能分解尿素的微生物
4.是否能根据选择培养基和完全培养基上的菌落数目来证明选择培养基具有筛选作用？
能 完全培养基的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数
3.两种培养基共有的培养基成分有： 。
培养基一的碳源为 ，氮源为 ；
培养基二的碳源为 ，氮源为 。
牛肉膏、蛋白胨
牛肉膏、蛋白胨
葡萄糖
尿素
水 碳源 氮源 无机盐
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一（普通）
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二（筛选能分解尿素的细菌）
二
微生物的选择培养
问题1：通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌,仅有选择培养基是不够的，还需要对土壤溶液进行什么处理
稀释涂布平板法
对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上
【任务1】请结合教材17页-18页第一段，思考以下问题：
１.简述稀释凃布平板法的操作步骤
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
10g
二
微生物的选择培养
（1）样品的稀释（梯度稀释菌液）
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
①铲取土壤，将样品装入纸袋中
（注意：铁铲和纸袋使用前要灭菌）
1.稀释凃布平板法
在酒精灯火焰旁完成。
1×10
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
微量移液器
1.稀释凃布平板法
（2）稀释涂布平板法操作
待涂布的菌液被培养基吸收
将平板倒置
30～37℃恒温培养1～2d后进行计数
1.稀释凃布平板法
（2）稀释涂布平板法操作
稀释涂布平板法，因为平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
思考：平板划线法与稀释涂布平板法哪种适用于细菌的计数？为什么？
1.稀释凃布平板法
平板划线法
稀释涂布平板法
稀释涂布平板法
显微镜进行直接计数
1.稀释涂布平板法进行计数的原理是什么？
2.稀释涂布平板法进行计数的原则是什么？
3.通过稀释涂布平板法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗 ？
4.如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？
5.用显微镜进行直接计数方法统计的细菌的数目与它的实的际数目相同吗
【任务2】请结合教材18页，思考以下问题：
三
微生物的数量测定
1.间接计数法—稀释涂布平板法
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(1)原理：
稀释涂布平板法计数的原理是什么？
①选择30-300个菌落的平板进行计数
(2)计数原则:
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
稀释涂布平板法进行计数的原则是什么？
稀释106倍
1.间接计数法—稀释涂布平板法
（细菌一般稀释104倍，105倍，106倍）
②每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的菌落数往往比活菌的实际数目少
通过此方法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗 ？
(3)计数特点:
1.间接计数法—稀释涂布平板法
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
每克（每ml）样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M 代表稀释倍数。
实例分析1：
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
(4)如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？
三
微生物的数量测定
每克土壤中可以分
离尿素的细菌数目
＝
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的做法正确吗？如果有问题，错在哪？
针对训练2：
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
三
微生物的数量测定
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
方法2：显微镜直接计数法
统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和
血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数；
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
三
微生物的数量测定
思考：统计的菌落数往往比活菌的实际数目多，原因是什么？
二、拓展应用
练习与应用（P20）
地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60% 能被
土壤中某些微生物分解利用，这是因为们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸杆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、 葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合
物 而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复
合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌
为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题
二、拓展应用
（2）纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
（3）这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
练习与应用（P20）
资料1：酚红指示剂是一种常用的酸碱指示剂，在PH为6.6—8.0时显示橙色，PH低于6.6显示黄色，PH高于8.4呈现红色。分解尿素的细菌能产生脲酶，脲酶将尿素分解成了氨，培养基PH升高，可使酚红指示剂变红。
资料2：检验饮水中是否含有大肠杆菌的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色。
鉴别培养基
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作 接种环在固体平板培 养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
注意事项 每次划线前后 均需灼烧接种环 稀释度要足够高，为确保试验
成功可以增加稀释度的范围
菌体获取 在具有显著的菌落特征 的区域菌落中挑取菌体 从适宜稀释度的平板
上的菌落中挑取菌体
优点 可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落，
又能对微生物计数
缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计

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