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第4单元
遗传的分子基础
第5课时　DNA片段的扩增(PCR)及电泳鉴定
内容索引
核心体系
学习目标
活动方案
检测反馈
学 习 目 标
学习目标　1. 概述DNA片段扩增(PCR)技术的原理及其过程。2. 概述PCR及电泳鉴定的操作方法。
核 心 体 系
活 动 方 案
PCR 技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图所示)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。请回答下列问题。
活动一　概述PCR技术的原理及其过程
(1) 生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是__________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_____________________。这两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的__________。
(2) 当温度降低时，引物与模板_______端结合，在________________ ____________的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是___________________，遵循的原则是_______________。
(3) PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP 、酶以外，至少还需要三个条件，即：含________(离子)液体环境、适宜的________和_________，前者由PCR仪自动调控，后者则靠_________来维持。
解旋酶
加热至90～95 ℃
氢键
3′
耐高温的DNA聚
合酶(Taq酶)
四种脱氧核苷酸
碱基互补配对
Mg2＋
温度
酸碱度
缓冲液
(4) 为什么PCR过程需要添加引物？PCR引物的化学本质是什么？其与细胞内DNA复制所需引物有何区别？
【答案】 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。PCR所需引物的化学本质是一段长度为20～30个核苷酸组成的DNA片段。细胞内复制所用引物是RNA短链，在体外扩增(PCR)需要的引物是DNA单链片段。
(5) PCR的首要任务就是引物设计，引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。PCR引物设计的依据是什么？设计引物时应注意哪些方面？
【答案】 PCR设计引物的依据是目的基因两端的部分核苷酸序列。PCR扩增DNA片段进行引物设计时，需要设计两种分别与两条模板链碱基互补的引物，两引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对，引物的长度既不能过长也不能过短。
(6) PCR技术中两条子链都是连续合成的，体内DNA是半不连续复制的，其原因是什么？
【答案】 在细胞内DNA复制时，双链只有部分打开，其中一条子链是连续合成，而另一条子链是不连续合成的。
(7) PCR技术需要的条件适宜，但又不同于细胞内DNA复制的条件，请从酶、原料、ATP等角度比较两者的区别。
【答案】 细胞内DNA复制需要解旋酶和DNA聚合酶，原料为4种游离的脱氧核苷酸，需添加ATP；PCR技术不需要添加ATP,4种dNTP既可作为原料又可提供能量,不需解旋酶,需要耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)。
(8) 目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是什么？
【答案】 PCR反应体系需要在较高温度条件下进行，因此PCR反应中需使用热稳定性高的Taq酶，而大肠杆菌的DNA聚合酶在高温下会失活。
在实验室中进行PCR的实验操作步骤主要包括准备、移液、混合、离心、反应五个步骤。PCR实验操作中，通常要用到微量离心管，具体操作时用微量移液器按PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可，一次PCR一般要经历30多次循环。请回答下列问题。
活动二　概述PCR的实验操作方法
项目 变性 复性 延伸
预变性 94 ℃，5 min — —
30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
(1) 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行怎样的处理？
【答案】 高压蒸汽灭菌。
(2) PCR实验操作时首先应进行预变性处理，其目的是什么？
【答案】 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构，使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好地和模板结合。
(3) 从上表可以看出PCR扩增过程中温度是关键因素，PCR仪实质就是一台自动控制温度的仪器。在PCR扩增时，复性(退火)阶段温度控制特别重要，该阶段的温度设置依据是什么？退火温度既不能过高又不能过低的原因什么？
【答案】 复性温度的设置与G—C含量有关，一般G—C含量高，退火所需温度相对较高。复性(退火)阶段温度过高，引物与模板不易结合；温度过低，引物与模板结合时特异性差。
(4) 一个目的基因通过PCR技术扩增n次时，总共需要多少个引物？扩增第n次时，需要多少个引物？第几次循环后，才会出现两端等长的目的基因片段？从理论上推测第四轮循环产物中，含有某种引物(如引物 Ⅰ )的DNA片段占比多少？
【答案】 2n＋1－2。2n。3。15/16。
(5) 如何利用PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否转录出mRNA
【答案】 ①提取受体细胞的DNA，设计一对引物，可以一个与染色体DNA互补结合，另一个引物与目的基因互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物(也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物)，之后再进行电泳检测。②提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法进行PCR扩增，之后再进行电泳检测。
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极方向移动。下图为DNA电泳实验操作步骤，请思考并回答下列有关问题。
活动三　概述DNA片段电泳鉴定
(1) 常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。PCR的产物(DNA片段)一般通过哪种方法进行鉴定？
【答案】 琼脂糖凝胶电泳。
(2) 电泳的原理利用了待分离样品中各分子___________的差异以及分子本身_______________的不同，使带电分子产生不同的__________，从而实现样品中各种分子的分离。
带电性质
大小、形状
迁移速度
(3) 若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的哪一极？
【答案】 负极。
(4) 利用PCR技术扩增的DNA片段是否成功，可以利用电泳的方法在紫外灯下直接观察到DNA条带，根据条带的分布及粗细程度来判断扩增的结果是否成功。正常扩增成功后进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？若电泳结果未出现条带，请分析可能的原因是什么。
【答案】 1条。未出现条带可能的原因：漏加了PCR反应成分、各反应成分的用量不当、PCR程序设置不当等。
(5) 若下图为某同学PCR扩增DNA片段后进行电泳的结果，正常的DNA片段大小应为多少bp？出现图中异常的条带数，可能原因有哪些？
【答案】 500。出现的条带数比正常电泳结果的条带数多可能的原因：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶质量不好等。
检 测 反 馈
2
4
5
1
3
7
6
1 [学生用书P129]在PCR的实验操作中，下列有关叙述错误的是(　　)
A. 在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头
B. 离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢
C. 用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合
D. 离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率
【答案】 A
2
4
5
1
3
7
6
2 [学生用书P130]聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95 ℃下使模板DNA变性、解链→55 ℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72 ℃下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述，错误的是(　　)
A. 变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B. 复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
C. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D. PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
【答案】 C
2
4
5
3
7
6
3 [学生用书P130]PCR技术是一种DNA的扩增技术。在一定条件下，加入模板DNA、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以实现DNA的扩增。据此判断不合理的是(　　)
A. dATP在DNA扩增中可以提供能量，同时作为DNA合成的原料
B. dTTP完全水解后产物有胸腺嘧啶、磷酸、核糖
C. DNA扩增过程未加解旋酶，可以通过先适当加温的方法破坏氢键，使模板DNA解旋
D. CTP水解脱去两个磷酸基后是组成RNA的基本单位之一
1
【答案】 B
2
4
5
3
7
6
4 [学生用书P130] (多选)基因启动子中胞嘧啶甲基化与生物的表观遗传密切相关。甲基化特异性PCR (MSP)技术是测定基因是否甲基化的常用方法，其主要原理及过程如下图。下列有关叙述正确的有(　　)
1
A. 基因启动子中胞嘧啶甲基化造成基因碱基序列的改变
B. MSP过程中应根据亚硫酸钠处理前后的碱基序列设计两对引物
C. PCR过程中甲基化组的退火温度比非甲基化组的高
D. PCR完成后，可采用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计对MSP产物进行鉴定分析
2
4
5
3
7
6
1
【解析】 胞嘧啶甲基化后仍为碱基胞嘧啶，因此基因启动子中胞嘧啶甲基化未造成基因碱基序列的改变，A错误；据图分析可知，未甲基化胞嘧啶经亚硫酸钠处理后变为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶经亚硫酸钠处理后仍为胞嘧啶，即通过亚硫酸钠处理前后碱基序列的比较可区分胞嘧啶是否甲基化，所以MSP过程中应根据亚硫酸钠处理前后的碱基序列设计两对引物，目的是通过观察是否产生两类PCR产物判断胞嘧啶是否甲基化，B正确。
【答案】 BCD
2
4
5
3
7
6
5 [学生用书P130] (多选)下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述，正确的有(　　)
A. PCR扩增过程中双链DNA解旋是通过加热实现的
B. 用于PCR扩增的Taq酶是一种耐高温的逆转录酶
C. PCR反应体系中需加入适量ATP溶液来驱动子链延伸
D. PCR扩增产物一般可通过琼脂糖凝胶电泳来进行鉴定
1
2
4
5
3
7
6
1
【解析】 与体内DNA复制时需要解旋酶解旋不同，PCR扩增过程中双链DNA解旋是通过加热实现的，A正确；用于PCR扩增的Taq酶是一种耐高温的DNA聚合酶，而非逆转录酶，B错误；PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行，不需要加ATP，C错误。
【答案】 AD
2
4
5
3
7
6
6 [学生用书P130]植物淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉两种，支链淀粉占贮存淀粉的70%～80%，是决定植物果实或种子品质的关键成分。玉米中包含SBE Ⅰ、SBEⅠb 和SBEⅠa 三种淀粉分支酶，前两者主要存在于胚乳中，SBEⅠa主要存在于叶片中，它们共同参与支链淀粉的合成。育种人员计划提取相关基因构建表达载体，用于改良马铃薯性状。
(1) 育种人员以中糯1号为材料，从玉米籽粒胚乳细胞中提取_______作为模板，经逆转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增以获取相应基因时，该过程需向反应体系中除添加引物、Taq酶等，还要提供_______，以提供反应所需的原料和能量。
(2) 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_______端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要的目的是_______________________________________。
1
mRNA
dNTP
5′
使目的基因片段能定向插入表达载体
2
4
5
3
7
6
(3) 经筛选及测序，育种人员最终选定长度为2 719 bp的SBE Ⅰb基因为目的基因，与载体经_________________________酶处理，重组后，构建表达载体，导入大肠杆菌构建文库。为检测导入效果，选取8个单菌落做PCR扩增，结果如图1所示。据此判断，泳道_________对应菌落为成功导入菌落。将筛选出的菌落扩大培养后提取质粒进行酶切实验，得到如图2所示结果，该结果可进一步证明上述结论，理由是___________ _____________________________________________________________。
1
限制酶和DNA连接
2和4
菌落质粒酶
切产物既包含质粒，同时也包含长度接近3 000 bp的目的基因序列
2
4
5
3
7
6
7 [学生用书P131]RT-PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示。请回答下列问题。
1
2
4
5
3
7
6
(1) 过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、______________、___________和引物A等。
(2) 过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是_______ ______________________________________________。
(3) 过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要________个引物B。
(4) 利用RT-PCR技术获取的目的基因_______(填“能”或“不能”)在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是___________________________________________ ________________。
(5) RT-PCR过程中主要借助对________的控制来影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。
1
RNA提取物
逆转录酶
让逆转
录酶变性失活，使mRNA－cDNA杂合双链解开
2n－1
能
增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓
度)，便于检测
温度
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