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第3章 基因工程
第二节
基因工程的基本操作程序
（第二课时）
思考：获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？
就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解
不能原因
那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？
二、基因表达载体的构建
（一）目的：
①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代;
（二）组成：
启动子：
基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA。
限制酶切割位点，
插入目的基因
终止子：基因的尾端，能终止mRNA的转录
标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。
②使目的基因能够表达和发挥作用
——基因工程的核心
基因表达载体=启动子+目的基因+终止子+标记基因+复制原点
（若需要能完成自主复制，还应有复制原点）
思考：目的基因该插入什么位置？
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
思考：启动子有哪些类型？
①组成型启动子：每种组织器官中均发挥作用。
②组织特异型启动子：特定组织器官中才能发挥作用。
③诱导型启动子：特定条件下刺激才能发挥作用。
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
诱导型启动子：
载体 ≠ 基因表达载体
二者都有：标记基因和复制原点两部分DNA片段。
基因表达载体：在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子。
思考： “载体”＝“基因表达载体”？
原因：
①生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
②通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
③目的基因导入受体生物中需要有筛选标记；
④为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调无件，如增强子等；
⑤有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因或做成目的基因与标记基因的融合基因，如绿色荧光蛋白基因。
思考: “启动子”＝“起始密码子”？
“终止子”＝“终止密码子”？
启动子（DNA分子中）≠ 起始密码子（mRNA分子中）
终止子（DNA分子中）≠ 终止密码子（mRNA分子中）
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
三、基因表达载体的构建过程：
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
思考：该过程需要用到基因工程哪些工具酶？
重组DNA分子
目的基因
一、目的基因的筛选与获取
（2）种类：编码蛋白质的基因（主），具有调控作用的因子（次）
1. 目的基因
（1）概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因
注意： 所有的基因都编码蛋白质或肽链。
不是
基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。
结构基因的功能：
具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。
转录基因的功能：
只有转录功能，没有翻译功能，能转录形成tRNA和rRNA。
调控基因的功能：
不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。
思考: 使用同一种DNA限制酶进行切割，会得到几种重组DNA？有何缺点？怎么改进？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
双酶切：选择2种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，得到两种不同的末端，可减少自身环化及反向连接等问题出现。
思考：如何防止自身环化和反向连接的问题？
双酶切
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
双酶切：切出的黏性末端不能再碱基互补配对
（一）方法
农杆菌转化法（主要）
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法（又叫感受态细胞法）
——我国科学家独创
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
基因枪法（了解）
受精卵或体细胞
主要是：受精卵
主要是：原核细胞
三、将目的基因导入受体细胞
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
目的基因
目的基因
适用生物：开花植物
1.将目的基因导入植物细胞
受体细胞：受精卵（或合子或早期胚胎细胞）
1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌是生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（2）农杆菌转化法
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，
实质都是基因重组
★★★原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质（如胰岛素）通常没有生物活性，因为没有经过内质网和高尔基体的加工，因此需要在体外进行再加工。
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到该细胞染色体的DNA上。
②原理：
目的基因
Ti质粒
表
达
载
体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
③过程：
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
③过程：
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
双子叶、裸子植物
受损
伤口分泌酚类物质和糖类物质
吸引农杆菌向受伤组织集中
将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞染色体DNA上。
激活Vir区基因，导致T-DNA加工和转移
③过程：
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
1）载体：
2）受体细胞：
第农杆菌Ti质粒
受精卵或体细胞
③过程：
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
3） 两次拼接
第一次拼接：
目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。
第二次拼接：
被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
③过程：
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
4）两次导入
第一次导入：
将目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌。
第二次导入：
含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
2.将目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
①体积大，易操作。②易表现出全能性。
（3) 过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
问题: 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
3.将目的基因导入微生物细胞
Ca2+处理法
Ca2+
感受态细胞
吸收
受体细胞
1）原核细胞（常选择大肠杆菌）
2）优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
Ca2+处理的目的
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 花粉管通道法、农杆菌转化法、基因枪法 显微注射技术 Ca2＋处理法法
受体细胞 受精卵或体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的T DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子
（二）将目的基因导入受体细胞——方法比较
在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
DNA水平：受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
RNA水平：目的基因是否转录出了mRNA
PCR或DNA分子杂交技术
蛋白质水平：目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
PCR或分子杂交技术等
四、目的基因的检测与鉴定
1，检测目的：
2.检测内容及方法
检测内容：目的基因是否插入到受体细胞的染色体DNA上（存在）
如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
检测方法：
方法①：PCR等技术
提取DNA
PCR操作
是否扩增出目的基因
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；
电泳操作
害虫死亡
抗虫棉
PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
（1）分子水平检测
检测方法：
方法②：DNA分子杂交技术(DNA单链——DNA单链)
检测工具：基因探针带有标记（放射性同位素标记、荧光分子标记等）的目的基因片段——单链
检测原理：将转基因生物的基因组DNA提取出来，用标记了的目的基因作为基
因探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目
的基因已插入染色体DNA中。
（1）分子水平检测
（1）分子水平检测
如：检测Bt基因是否转录出mRNA
Bt
M3
C0
T-9
T-2
T-51
T-5
T-23
T-11
T-20
T-21
T-34
T-10
10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录
提取mRNA
PCR操作
是否扩增出目的基因
对扩增产物进行检测
害虫死亡
抗虫棉
逆转录
产生DNA
检测内容：目的基因是否转录
检测方法：
方法①：PCR等技术
（1）分子水平检测
检测内容：目的基因是否转录
检测方法：
方法②：分子杂交技术
（DNA—RNA）——分子杂交
检测原理：用标记的目的基因作为基因探针，与转基因生物中提取
mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出mRNA。
PCR等技术
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。
方法：DNA分子杂交
分子杂交
（1）分子水平检测
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
检测内容：目的基因是否翻译
检测方法：抗原—抗体杂交检测
检测原理：抗原与抗体特异性结合
抗原—抗体杂交技术
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
过程
2.个体水平的检测
检测内容：转基因生物是否具有相应性状
检测方法：
转Bt基因
非转基因
没有抗虫基因的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
抗虫或抗病接种实验
基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较
如：采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
小结：个体水平的检测
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
——“抗原—抗体杂交技术”
2.个体生物学水平鉴定
1.分子水平检测
抗性检测：
功能活性比较：
PCR技术
DNA分子杂交技术
抗虫、抗病接种实验；
基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较
——检测是否具有抗性以及抗性强度等
如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠体内观察血糖变化
如：采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。
PCR技术
分子杂交技术
小结：目的基因的检测与鉴定

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