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(共39张PPT)
第3章 基因工程
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
（核心）
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
第二节
基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取
（2）种类：编码蛋白质的基因（主），具有调控作用的因子（次）
1. 目的基因
（1）概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因
注意： 所有的基因都编码蛋白质或肽链。
不是
基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。
结构基因的功能：
具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。
转录基因的功能：
只有转录功能，没有翻译功能，能转录形成tRNA和rRNA。
调控基因的功能：
不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。
编码区：
非编码区：
原核基因
真核基因
编码区
非编码区：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列
(如启动子、终止子等）
外显子：
内含子：
在细胞核转录出mRNA后，在翻译前被剪切掉
能转录相应的mRNA，进一步能编码出蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列
(如启动子、终止子等）
原核生物
真核生物
编码区（转录区）
非编码区
非编码区
启动子
启动子
终止子
终止子
外显子
内含子
（3）基因的结构
不能编码蛋白质的序列
= 非编码区
原核生物的基因：
不能编码蛋白质的序列
真核生物的基因：
= 非编码区+内含子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
（2）实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
（1）较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
功能清晰
已知结构
2. 筛选合适的目的基因
（3）认识基因结构和功能的技术方法
测序技术→序列数据库（如GenBank）→序列对比工具（如BLAST）
Q1：Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
Q2：为什么Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
Q3：明确了目的基因后，该怎么获得它呢？
3. 获取目的基因的方法
（1）人工合成目的基因：（目的基因较小且全部序列已知）
（2）从基因文库中获取
基因组文库
部分基因文库（如cDNA文库）
（3）利用PCR获取和扩增目的基因
DNA合成仪
方法一：人工合成目的基因
①前提：
②方法：
目的基因比较小、核苷酸全部序列已知
DNA合成仪→直接合成目的基因
Q3：化学合成法 （能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类的要求。
不含；参与翻译的mRNA序列是由编码序列转录而来。
Q1：化学法合成的目的基因 （含/不含）内含子、启动子和终止子？
多种；遗传密码具有简并性或一种氨基酸可能由多个密码子决定。
Q2：若是控制同一种蛋白质合成的目的基因，利用化学合成法合成的基因可能有 （一种/多种），理由是？
能
（主要指cDNA文库）
基因文库
基因组文库
部分基因文库
方法二：从基因文库中获取目的基因
基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体，如cDNA文库。
提取某种生物的全部DNA
基因组所有基因
将每个基因与载体连接，导入不同受体菌中储存
用适当的限制酶切割
基因组文库
构建
①基因组文库的构建
基因组文库中的基因含启动子、终止子和内含子！
某种生物（某一发育时期）的（成熟的）单链mRNA
与mRNA互补的单链DNA
双链cDNA片段
导入不同受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
构建
②部分基因文库（如cNDA文库）的构建
注意：cDNA文库中的基因不含启动子、终止子和内含子。
PCR扩增仪
PCR技术由穆里斯等人于1985年发明，
于1993年获得诺贝尔化学奖。
方法三：利用PCR获取和扩增目的基因
①PCR技术的概况
PCR是_______________的缩写，是一项根据___________
________的原理，在____提供参与DNA复制的_______与_________，对____________________进行________的技术；
聚合酶链式反应
DNA半保
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
留复制
原理
操作环境
目的
优点：
利用PCR：
①扩增已得到的基因；
②获取并扩增DNA分子中的目的基因。
解旋酶（氢键断裂）
DNA聚合酶（形成磷酸二酯键）
氢键的形成是自发的，不需要能量和酶
（1）模板：亲代DNA的两条链
（2）原料：4种游离的脱氧核苷酸
（3）能量：ATP
（4）酶：
DNA体内复制的条件
②PCR技术所需的基本条件
通过控制温度使DNA复制在体外反复进行
PCR扩增仪
参与的组分 在DNA复制中的作用
模板：2条DNA母链 提供DNA复制的模板
原料：dNTP(4种脱氧核苷酸) 合成DNA子链的原料
能量：dNTP 为合成DNA子链供能
解旋酶：体外用高温代替 打开DNA双链
DNA聚合酶：耐高温（Tap酶） 催化合成DNA子链
引物：2种小分子DNA片段 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始
连接脱氧核苷酸
一定的缓冲液（Mg2＋） Mg2＋激活真核细胞和细菌的
DNA聚合酶
dNTP的作用：
既可作为合成DNA子链的原料，
又可为DNA的合成提供能量。
4种脱氧核苷酸
(实质是4种脱氧核苷三磷酸dNTP)
1）原料：
③PCR的条件解读：
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献（P86）
2）耐高温的DNA聚合酶
③PCR的条件解读：
Ⅰ. 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
长度通常为20~30个核苷酸。
若引物长度过短，则：引物与模板链结合的特异性较差。
细胞中：一段单链RNA PCR中：一段人工合成的单链DNA
Ⅱ. DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能，引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，
使DNA聚合酶从3′端延伸子链。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
Ⅲ. 由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需要2种引物。
2）引物
③PCR的条件解读：
PCR的过程
目的基因DNA__________后__________，______与单链相应互补序列结合；然后以___________为模板在____________作用下进行_____，即将4种____________加到____________，如此重复循环多次。
受热变性
解为单链
引物
延伸
单链DNA
DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，即成_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
产物
模板
一倍
指数
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
③PCR反应过程归纳
第1步：变性
当温度>90℃时，双链DNA解旋为单链。断氢键
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
1)变性
2)复性
3)延伸
冷却
加热
预变性 90 ℃以上 增加大分子模板DNA彻底变性的概率
③PCR扩增目的基因的过程：
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
5’
3’
3’
5’
第2步：复性
5’
3’
3’
5’
1)变性
2)复性
3)延伸
冷却
加热
③PCR扩增目的基因的过程：
③PCR扩增目的基因的过程：
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，加到引物的3’端，合成新的DNA链。DNA新链延伸的方向： 5’端 → 3’端
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
第3步：延伸
1)变性
2)复性
3)延伸
冷却
加热
④结果：
指数形式扩增加的原因：一个循环得到的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
⑤PCR扩增产物的鉴定：
琼脂糖凝胶电泳
以指数方式扩增，产生2n个DNA片段
100bp
200bp
300bp
400bp
500bp
600bp
700bp
800bp
1,200bp
1,000bp
900bp
标准
样品1
样品2
样品3
较小的DNA片段在凝胶中移动相对容易，较大的DNA片段移动难。当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（标准），这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
单链RNA
DNA-RNA杂交分子
单链DNA
双链DNA
逆转录酶
核酸酶H
降解RNA链
DNA聚合酶
mRNA不可以直接扩增，需逆转录成cDNA再进行扩增，称为逆转录PCR，简称RT-PCR。
Q：利用PCR可以扩增mRNA吗？
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
目的基因
目的基因
Q：利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？
第一轮循环
第二轮循环
第三轮循环
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
非目的基因序列
目的基因序列
引物
第一轮循环
基因数=
2=21
引物数=
2=22-2
基因数=
4=22
引物数=
6=23-2
第二轮循环
第三轮循环
基因数=
8=23
引物数=
14=24-2
n次循环后，目的基因数为2n，需要引物数为2n+1-2。
⑥PCR相关计算
第一轮循环
第二轮循环
第三轮循环
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
⑥PCR相关计算
第一轮 第二轮 第三轮 第N轮
DNA分子数
含引物A或引物B的DNA分子数
同时含引物A和引物B的DNA分子数
共消耗引物数
2n－1
7
1
3
0
2
6
2n－2
2
6
14
2n+1－2
21
22
23
2n
⑥PCR相关计算
第一轮 第二轮 第三轮 第N轮
长链－中链组合的DNA分子数
中链－短链组合的DNA分子数
短链－短链组合的DNA分子数
2
0
0
2
2
2
0
2
4
2
2n-2
2n-2n
长链条数：始终是最初DNA分子的两条链。
中链条数：始终是最初DNA分子的两条长链为模板形成的，并且每复制一次，新形成的中链增加两条。
短链条数：所有的DNA分子中，除长链和中链外，余下的即为短链。
5’
3’
3’
5’
Q1：引物是什么？
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。
若引物长度过短，则：引物与模板链结合的特异性较差。
细胞中：一段单链RNA，PCR中：一段人工合成的单链DNA。
⑦关于引物的若干问题
Q2：为什么需要引物？
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
Q3：引物的作用？
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
Q4:设计引物的依据是？
Q5:为什么延伸时需要加入两种引物？
目的基因两端的核苷酸序列。
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。
Q6:两种引物与模板链的哪一端配对？
3’
5’
3’
5’
引物的5′端与模板链的3′端互补配对
Q7:引物设计的要求（或引物失效的原因）？
引物设计的要求：
a.引物自身不能环化。
b.两种引物之间不能发生碱基互补配对。
c.引物长度不宜过短，防止引物随机结合。
d.引物太短则特异性不够强；太长则退火温度会比较高。
第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
Q8:引物的3'端和5'端哪个能改造？
引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基,一般不能改造，5'端无严格限制,可用于添加限制酶切割位点等序列
可在引物的5'端加上限制酶的识别序列。
Q9:为了便于将扩增的DNA片段与运载体连接，可如何操作？
使目的基因定向（正确）插入载体并避免目的基因自身环化。
Q10:在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列,主要目的是？
⑦PCR技术与生物体内DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
不同点 场所
解旋方式
酶
引物
温度
能量
子链合成
结果
相同点 原则、方式 条件 子链延伸方向 DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
主要在细胞核内
DNA聚合酶、解旋酶
大量的DNA片段或基因
形成整个DNA分子
单链RNA片段
一般为单链DNA片段
体内温和条件
一条子链连续合成，另一条子链不连续合成
两条子链都是连续合成
ATP提供能量
dNTP提供能量
碱基互补配对、半保留复制
模板、引物、酶等
从5′端到3′端
耐高温的的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
需控制温度，在较高温度下进行

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