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(共18张PPT)
第3章 基因工程
第二节
基因工程的基本操作程序
（第三课时）
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等
小结
基因工程的基本操作程序
检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
（二）个体生物学水平鉴定
方法：
抗虫或抗病接种实验
PCR等技术
——“抗原—抗体杂交技术”
PCR和核酸分子杂交技术可更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因！
方法1：PCR等技术
转基因生物
提取DNA
根据目的基因的序列设计PCR引物
PCR操作
是否扩增出目的基因
琼脂糖凝胶电泳
DNA测序技术
你知道PCR会扩增出哪些不同的片段吗？
只含目的基因片段
目的基因在整个DNA片段的中央位置
复制3次后
这两个DNA分子量相同吗？
种类1
种类2
种类3
种类4
种类5
怎么鉴定PCR的产物？
电泳！
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
一、实验原理
（一）DNA体外扩增的原理：
PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
（一）琼脂糖凝胶电泳的原理：
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
电泳：
在电场的作用下，DNA、RNA、蛋白质等这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
正极
负极
电场力
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
二、实验材料
（一）仪器：
PCR仪
微量离心管
电泳装置
微量移液器
自动控温，实现DNA的扩增
实际上是进行PCR反应的场所
用于向微量离心管转移PCR配方中的液体
包括电泳仪、电泳槽等
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
二、实验材料
（二）材料：
①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
③PCR反应体系的配方(见教材)
②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
三点提醒
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
1
2
3
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
三、实验步骤
移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
扩增：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
（一）PCR扩增：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
三、实验步骤
熔化：电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
倒模：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
凝固：待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
（二）制备琼脂糖凝胶
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
三、实验步骤
加液：将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
加样：扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
（三）进行电泳
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
三、实验步骤
观察鉴定：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
（四）观察鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
四、注意事项
注意事项
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
③该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
④在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
②在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
五、结果分析
Q1：你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
该片段大小约为750bp。
若出现一条条带，表明PCR扩增是成功的。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
五、结果分析
Q2：如果未出现条带或出现不止一条条带，可能原因是什么？
未出现扩增条带可能的原因有：
①TaqDNA聚合酶失活；
②引物出现质量问题；
③变性时温度低，变性时间短；
④Mg2+浓度过低。
出现非特异性扩增带可能的原因有：
①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；
②复性时的温度过低；
③DNA聚合酶的浓度过高；
④模板DNA出现污染；
⑤Mg2+浓度过高。

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