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第3章 基因工程
1.基因是什么？
2.基因的功能是什么？
基因通过控制蛋白质的合成，直接或间接控制生物的性状。
转录
DNA
mRNA
蛋白质
翻译
（RNA聚合酶）
——体现相关的生物性状
知识回顾——基因
基因通常是有遗传效应的DNA片段。
①DNA中文全称:　　　　　　　
②组成元素:　　　　　　　　
③基本单位:　　　　　　　　　
脱氧核糖核酸
C H O N P
脱氧核糖核苷酸
= 磷酸 + 脱氧核糖 + 含氮碱基
1′
4′
3′
2′
5′
A T G C
脱氧核苷酸
(4种)
知识回顾——DNA
鸟嘌呤脱氧核苷酸
胞嘧啶脱氧核苷酸
胸腺嘧啶脱氧核苷酸
腺嘌呤脱氧核苷酸
脱氧
核糖
含氮碱基
磷酸
OH
脱氧核苷酸如何连接成脱氧核苷酸链的呢？
脱氧
核糖
T
P
磷酸二酯键
脱氧
核糖
C
P
脱氧
核糖
A
P
脱氧
核糖
G
P
氢键
A
P
脱氧
核糖
C
P
脱氧
核糖
T
P
脱氧
核糖
G
P
脱氧
核糖
5′
3′
5′
3′
5′
5′
3′
3′
OH
OH
DNA的结构特点：
5’
3’
3’
5’
② 和 交替连接，排列在外侧，构成 ； 排列在内侧。
③两条链上的碱基通过 连接成碱基对，且遵循 。
①DNA是由两条单链组成的，这两条链
按 方式盘旋成双螺旋结构。
反向平行
脱氧核糖
磷酸
碱基
基本骨架
氢键
碱基互补配对原则
简图：
①磷酸二酯键
②氢键
…… ATGCCGTGGAATTCC ……
…… TACGGCACCTTAAGG ……
①
②
抗虫棉的培育
苏云金杆菌
毒蛋白基因
毒蛋白
杀死害虫
棉花细胞
基因工程的概念
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此 又叫重组DNA技术。
操作环境及操作对象
原理
操作水平
结果
体外环境；基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
目的基因
受体细胞
目的基因的表达产物
理论基础
1.DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）
2.都遵循碱基互补配对原则
3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
理论基础
1.基因是控制生物性状的结构与功能单位
2.遗传信息的传递都遵循中心法则
3.生物界几乎共用一套遗传密码
3.1 重组DNA技术的基本工具
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
来源：
主要是从原核生物中分离纯化出来的
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
3.命名：
粘质沙雷氏杆菌
（Serratia marcesens）
大肠杆菌
（Escherichia coli R）
EcoRⅠ 限制酶
SmaⅠ 限制酶
2.种类：
数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
3、作用：
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
专一性
，
识别序列的特点：
1.大多数识别序列由6个核苷酸组成，也有少数由4个，8个或其他数量的核苷酸组成。限制酶都可以找到一条中心轴线。中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
2.一条链从5’往3’读的碱基顺序与另一条链从 5’往3’读的顺序完全一致。
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamHⅠ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
限制酶
G
1’
2’
3’
4’
5’
1’
2’
3’
4’
5’
A
磷酸二酯键
T
G
C
C
G
T
A
A
4、作用部位:
特定部位上的磷酸二酯键
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
EcoR Ⅰ
(在G与A之间切割)
中轴线
黏性末端
产生黏性末端或平末端
5.切割结果：
当限制酶在它识别序列的___中轴线两侧________将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是___黏性末端_______；
当限制酶在它识别序列的__中轴线处_____切开时，产生的是_平末端____；
中轴线
平末端
Sam Ⅰ
(在G与C之间切割)
限制酶存在于原核生物中的作用是什么
原核生物容易受到外源DNA的入侵
限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效
保证自身的安全
限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA
DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者DNA分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开
【思考】
（1）实例1——EcoRⅠ限制酶切割，SmaⅠ限制酶切割
EcoRⅠ识别序列为GAATT切割部位为GA之间的磷酸二酯键。SmaⅠ识别序列CCCGGG。切割部位为CG之间的磷酸二酯键
*形成的黏性末端从5’往3’读为__________
*一个限制酶切割一次形成_______个黏性末端
*同一种限制酶切割形成的黏性末端_________
*两个黏性末端有__________个游离的磷酸基团。
AATT-
两
相同
2
下列是由同种限制酶切割形成的DNA片段是（ ）
①…CTGCA …
G
②…G
…CTTAA
③ G…
ACGTC…
④ AATTC…
G…
A. ①③；②④ B. ①②；③④ C. ①④；②③ D.以上都不对
A
下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
DNA连接酶——“分子缝合针”
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
作用：
作用部位：
磷酸二脂键
种类：
①E.coli DNA连接酶
②T4 DNA连接酶
从大肠杆菌中分离得到
只能连接互补黏性末端的DNA片段
从T4噬菌体中分离得到
黏性末端和平末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。
平末端
黏性末端
那怎样使DNA片段才能产生相同（互补）的黏性末端？
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GCCGTATG…
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
实例： 重组DNA分子的模拟操作
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
用同尾酶切割也能得到相同黏性末端。
练习1、已知限制酶I的识别序列和切点是—GGATCC—限制酶II的识别序列和切点是—GATC—。
（1）则能被限制酶I切割的DNA, （ 能/不能）被限制酶II切割；
（2） 能被限制酶 II切割的DNA， （能/不能/不一定能）被限制酶I切割。
（3） DNA1被限制酶I切割，DNA1被限制酶II切割，加入DNA连接酶可得到DNA1和DNA2的重组DNA片段，该重组DNA片段 （能/不能/不一定能）被限制酶I切割， （能/不能/不一定能） 被限制酶1切割。
能
不一定能
不一定
能
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。
不同点：DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸，需要模板；
DNA连接酶连接的是DNA片段，不需要模板。
DNA聚合酶
DNA连接酶
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶——“分子缝合针”
总结归纳
几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
碱基对之间
的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，
形成两条长链
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将DNA切成两个片段
下图为 DNA 分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是：（ ）
A.①②③④ B.①④②③
C.①②④③ D.①④③②
B
学以致用
三 基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”
由于目的基因是比较大的分子，不太容易进入另一细胞的，但是科学家发现有些生物的DNA很容易进入细胞内。那目的基因如何进入另一细胞？
通常是利用 质粒作为载体，将目的基因送入受体细胞中。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状 DNA分子。
在基因工程中使用的载体除质粒外，还有
动植物病毒、噬菌体等。
一段特殊的DNA序列，DNA聚合酶的识别和结合位点
作用
种类
3.载体需具备的条件
（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
（2）有一个至多个限制酶切点
（3）有特殊标记基因
供外源DNA片段插入其中
便于重组DNA分子的鉴定和选择
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
A.有的可以独立地进行自我复制
B.有的则整合到宿主细胞染色体DNA上，随着宿主细胞染色体DNA的复制而同步复制
标记基因通常有:
①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)
②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
思考：形成一个重组质粒会形成 个磷酸酯键
4
重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低
例2、普通的细菌一般是对抗生素 敏感的，在含有青霉素或四环素的培养基中不能生长。如果给普通细菌导人一个含有四环素抗性基因的质粒，四环素抗性基因的表达产物可使细菌获得抵抗四环素的性状。

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