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第3章 基因工程
第一节
重组DNA技术的的基本操作工具
我国是棉花生产大国，但棉花植株常会受到棉铃虫的侵袭，使棉花产量减少1/3，甚至绝收。大量施用农药杀虫不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。苏云金杆菌可以合成一种抗虫毒素——Bt毒蛋白，如何能培育出具有抗虫性的棉花新品种呢？
杂交育种？诱变育种？可以实现吗？为什么？
杂交育种：同种生物之间进行；
诱变育种：在原有基因基础上发生基因突变，
　　　　　结果产生新基因——等位基因（不定向）
基因工程育种：克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物性状。
毒死害虫
毒蛋白基因
棉花细胞
苏云金杆菌
与载体DNA拼接，导入
毒蛋白
抗虫棉的培育过程
目的基因←
→受体细胞
→基因表达产物
1.概念：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
一、基因工程的概念及解读
①别名：
②变异原理：
③操作对象：
④操作水平：
⑥结果：
重组DNA技术
基因
DNA分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
⑤基本过程：
剪切→拼接→导入→表达
⑦优点：
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状
例如：通过转基因技术，可以实现大肠杆菌生产人的胰岛素，在此实例中，目的基因是 ，受体细胞是： ，目的基因的表达产物是： 。
人胰岛素基因
大肠杆菌
人胰岛素
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
2.基因工程的诞生和发展
×
√
√
×
√
√
思考1：为什么不同种生物的基因能拼接在一起？理论基础是什么？
思考2：为什么外源基因在受体细胞内能够成功表达出相应的蛋白质呢？
理论基础是什么？
复制
转录
翻译
重组DNA
逆转录
复制
蛋白质
理论基础
1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)
2.都遵循碱基互补配对原则
3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
理论基础
1.基因是控制生物性状的结构与功能单位
2.遗传信息传递都遵循中心法则
3.生物界几乎共用一套遗传密码
3. 基因工程的理论基础
（1）不同种生物的基因能拼接的理论基础
（2）外源基因在受体细胞内能表达的理论基础
RNA
思考3：培育转基因抗虫棉需要哪些关键步骤？
关键步骤一：
抗虫基因从苏云金芽孢杆菌DNA中提取出来
关键步骤二：
抗虫基因与载体“缝合”
关键步骤三：
抗虫基因导入棉花细胞
二、 重组DNA技术的基本工具
（三）分子运输车---载体
（一）分子手术刀---限制酶
（二）分子缝合针---DNA连接酶
“手术刀”
“缝合针”
“运输车”
识别特定核苷酸序列，断开磷酸二酯键
——专一性
（一）限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.简称：
限制酶
2.来源：
原核生物（主）
4.作用：
A
T
C
G
T
A
G
C
5’
3’
5’
3’
磷酸二酯键
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
3.种类：
数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
5.识别序列：
大多数：6个
少数：4个、8个或其他数量
6.作用部位：
特定部位的磷酸二酯键
大多数限制酶：识别序列由6个核苷酸组成，例如EcoRⅠ、SmaⅠ，
少数限制酶：由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
G A A T T C
C T T A A G
5’
3’
3’
5’
中心 轴线
G
C T T A A
A A T T C
G
中心轴线两侧切开
黏性末端
EcoRⅠ
（1）EcoRⅠ 限制酶能特异性识别 序列（5’→3’方向），在识别序列的中心轴线两侧，切割 和 之间的 ，切割后产生 。
GAATTC
G
A
磷酸二酯键
黏性末端
7. 作用结果：
产生的DNA片段末端通常有两种形式——____________和__________
黏性末端
平末端
注意：
★G：鸟嘌呤脱氧核苷酸
★A：腺嘌呤脱氧核苷酸
C C C G G G
G G G C C C
5’
3’
3’
5’
中心 轴线
C C C G G G
G G G C C C
中心轴线处切开
平末端
SmaⅠ
（2）Sma I 限制酶能特异性识别 序列（5’→3’方向），在识别序列的中心轴线处，切割 和 之间的 ，切割后产生 。
CCCGGG
C
G
磷酸二酯键
平末端
7. 作用结果：
产生的DNA片段末端通常有两种形式——____________和__________
黏性末端
平末端
限制酶是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。限制酶的命名是根据细菌种类而定，
以EcoR I为例：
E：Escherichia （属名）
co：coli （种加词）
R：RY13 （品系）
I：分离出的第一种限制酶
8.限制酶名字的由来
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一种限制酶
【练习】：写出下列限制酶切割形成的末端序列，并思考有何特点？
BamHⅠ EcoRⅠ__________________________
Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________
-G
-CCTAG-
-G
-CTTAA-
-A
-TTCGA-
-A
-TCTAG-
or
-GATCC-
G-
or
-AATTC-
G-
or
-AGCTT-
A-
or
-GATCT-
A-
同种限制酶切割产生的黏性末端一定相同,
不同种的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。
结论1：
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
……CTACGATG
……GATGCTACTTAA
AATTCCCTAA……
GGGATT……
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
黏性
末端
目的基因
在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性核酸内切酶切割（需切 处），会产生 个末端。
结论2：
2
4
① —A
—TGATC
④ CTAGA—
T—
② CTAGT—
A—
③ —T
—AGATC
—T
—AGATC
CTAGT—
A—
①②
③④
②③ / ①④
判断以下任意两个黏性末端是否为同一种限制酶切割产生？
判断两个黏性末端是否为同一种限制酶切割产生的依据：
①一看裸露碱基是否相互配对；
②二看切割位点是否相同。
结论3：
—G AATTC—
—CTTAA G—
思考：你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
限制酶在原核生物中主要起防御作用，切割外源DNA，以防止外来病原物的侵害，保证自身的安全。
结论4：
思考：限制酶来源于原核生物，为什么不切割自己的DNA分子？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶识别的特定核苷酸序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
原核生物DNA分子中不存在该限制酶的识别序列或识别序列已经被修饰（如发生甲基化）
结论5：
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割（EcoRⅠ）
思考：如何将苏云金芽孢杆菌抗虫基因与载体“缝合”？
思考：如何将苏云金芽孢杆菌抗虫基因与载体“缝合”？
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
基因的针线：DNA连接酶
1. 作用：
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
（二）DNA连接酶——“分子缝合针”
磷酸二酯键
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
2.作用部分：
磷酸二酯键
3.分类：
类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 ____________ ____________
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
注意：DNA连接酶没有识别序列的特异性
CTTCATG
GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA
GGGATT
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
TCTTCATG
AGAAGTACTTAA
AATTCCCTAAG
GGGATTC
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
思考：DNA连接酶能连接两条单链DNA的缺口吗？
DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
结论6：
思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
A A T T G
不是，DNA聚合酶以DNA的一条链作为模板，连接游离的脱氧核苷酸，形成磷酸二酯键。
结论7：
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成与模板链互补的DNA链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
4.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：
只能将单个脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
5.与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
１１１１１
１１１１１
１１１１１
１１１１１
１１１１１
１１１１１
１１１１１
１１１１１
练习：已经限制酶I的识别序列和切点是： ，
限制酶II的识别序列是：
（1）能被限制酶I切割的DNA， (能 /不能)被限制酶II切割；
（2）能被限制酶II切割的DNA， (能 /不能/不一定能)被限制酶I切割；
（3）DNA1被限制酶I切割，DNA2被限制酶II切割，加入DNA连接酶可得到DNA1和DNA2的重组DNA片段，该重组DNA片段 (能 /不能/不一定能)被限制酶I切割， (能 /不能/不一定能)被限制酶II切割。
能
不一定能
不一定能
能
(三)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用: ①　　　　　　　　　　　　　 　　　　　。
②　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
将目的基因转移到受体细胞中
在受体细胞内对目的基因进行大量复制
2.作为运载体需具备的条件:
①有一个至多个限制酶切割位点，便于外源DNA片段（目的的基因）插入。
②能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
③常有特殊的标记基因（如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等），便于重组DNA分子的筛选。
④对受体细胞无害，易分离。
种类 用途 不同点
质粒、 噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
3.种类:
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
DNA复制并带着插入的目的基因一起复制
有一个或多个
限制酶酶切位点
标记基因的常见类型：
①抗性基因
②荧光蛋白基因
4.最常用的载体——质粒
★★★标记基因的作用：
用于鉴别和筛选含有重组DNA分子的受体细胞
①添加易于识别的标记基因，如抗生素的抗性基因；
②添加一段由数个酶切位点组成的一段核苷酸序列；
③添加增强子，提高转录效率；
④剔除对受体细胞有害的基因;
注意：
真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的：
⑤删除非必要的DNA区域等。
知识扩展：：普通的细菌一般对抗生素 （敏感/不敏感），在含有青霉素或四环素的培养基中 （能/不能）生长。如果给普通细菌导入一个含有青霉素抗性基因的质粒，青霉素抗性基因的 可使细菌获得抵抗青霉素的性状。
不存活
存活
敏感
不能
表达产物
5.利用标记基因进行筛选的原理
典例：某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
→四环素抗性基因
氨苄青霉素抗性基因←
6.利用标记基因进行筛选的实例
结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种：
含有环状目的基因；
含有质粒载体；
含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
未被转化的
大肠杆菌
（普通大肠杆菌）
含有环状目的基因的大肠杆菌
含有质粒载体的
大肠杆菌
含有插入了目的基因的重组质粒的
大肠杆菌
→四环素
抗性基因
氨苄青霉素
抗性基因←
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是___________________________________
___________________________________________；并且_________________和____________________的细胞也是不能区分的，其原因是________________________________________________________________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有_____________的固体培养基。
未被转化的
大肠杆菌
（普通大肠杆菌）
含有环状目的基因的大肠杆菌
含有质粒载体的
大肠杆菌
含有插入了目的基因的重组质粒的
大肠杆菌
二者均不含氨苄青霉素抗性基因，
在该培养基上都不能生长
含有质粒载体
含有重组质粒的
二者都含氨苄青霉素抗性基因，
在该培养基上均能生长
四环素
未被转化的
大肠杆菌
（普通大肠杆菌）
含有环状目的基因的大肠杆菌
含有质粒载体的
大肠杆菌
含有插入了目的基因的重组质粒的
大肠杆菌
甲： 物质
乙： 物质
在含乙的培养基中，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌生存状况为 （存活/死亡）。
氨苄青霉素
四环素
死亡
7.酶切位点的选择
图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
(1)上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏 和 。
(2)在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后， 。
目的基因
抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
7.酶切位点的选择
(3)在基因工程的操作中，若只选Pst I这种限制酶进行切割，可能会造成什么后果？如何解决？
若只选Pst I这种限制酶进行切割，可能造成目的基因和质粒的自身环化、目的基因与质粒的反向连接等问题。
图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
双酶切
选择酶切位点的原则
小结：
①选目的基因两端和载体都有的酶切位点；
②所选酶切位点不能破坏目的基因和标记基因；
③切割质粒时，至少保留一个完整的标记基因，便于筛选；
④为避免目的基因和质粒的自身环化、目的基因与质粒的反向连接，应
使用不同的限制酶分别切割含有目的基因的DNA片段和质粒，如图可
选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶，该方法称为双酶切法。
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结

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