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(共26张PPT)
资料1: 我国是棉花的生产和消费大国，以新疆棉最为著名。在棉花种植过程中，常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。而大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。
资料2:苏云金杆菌有一种杀虫基因/Bt毒蛋白基因，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
重组DNA技术的基本工具
高中生物选择性必修三
3
基
因
工
程
目
标
社会责任
关注基因工程的诞生和发展历程，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。
科学思维
探究DNA的物理与化学性质，进行DNA分子的提取与鉴定。
生命观念
运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。
基因工程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
是指按照人们的愿望，
通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特
性，创造出更符合人们需要的新的生物类型
和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程
基因工程
DNA连接酶
“分子缝合针”
基因进入受体细胞的载体
“分子运输车”
限制性内切核酸酶
“分子手术刀”
原理：基因重组（广义）
基因工程
不同生物的基因为什么能拼接？
为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达
基因工程
基因在空间上转移并成功表达
DNA（基因）
转录
翻译
mRNA
蛋白质
表达基础
基因工程
基因工程
拼接基础
①基因是控制生物性状的结构与功能单位
②遗传信息的传递都遵循中心法则
③生物界几乎共用一套遗传密码
①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）
②都遵循碱基互补配对原则
③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
特点
作用部位
来源
种类
识别序列长度
结果
主要从原核生物中分离纯化来的
特定切点上的磷酸二酯键。
数千种
能够识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
限制酶不是一种酶，而是一类酶。
大多数是6个核苷酸序列。
产生黏性末端或平末端。
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
EcoR Ⅰ
Sam Ⅰ
粘性末端
平末端
识别序列为
GAATTC
切割部位为
GA之间
识别序列为
CCCGGG
切割部位为
CG之间
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
同种限制酶产生黏性末端相同，不同限制酶可能切割形成相同黏性末端。
同尾酶 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
DNA连接酶 ——“分子缝合针”
作用
种类
将双链 DNA双链片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
从大肠杆菌中分离得到
连接互补黏性末端
从T4噬菌体中分离得到
黏性末端与平末端均可连接，但连接平末端的效率相对比较低。
DNA连接酶 ——“分子缝合针”
由于黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对形成氢键，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能，所以T4 DNA连接酶黏性末端的连接速度比平末端的连接速度更快。
DNA连接酶 ——“分子缝合针”
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。
不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；
DNA连接酶连接的是DNA片段。
DNA连接酶 ——“分子缝合针”
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
载体的作用是什么？
有哪些种类？
常用的载体是哪种？其有什么特征？
作为载体应具备什么条件？
阅读教材P73，回答下列问题：
作用
种类
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
将目的基因转入受体细胞。
通常是用质粒，噬菌体、动植物病毒也可以。
真核生物如酵母菌中也存在质粒。
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
目的基因插入位点
复制原点
氨苄青霉
素抗性基因
DNA的粗提取及鉴定
01
02
03
04
自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
有一个至多个限制酶切割位点
对受体细胞无害、易分离
具有多种特殊的标记基因
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
供外源DNA片段(基因)插入其中
对受体细胞无害，避免受体细胞受到损伤
便于筛选含有重组DNA分子的细胞
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒基础上进行过人工改造。
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
取出
转移
DNA连接酶——“分子缝合针”
基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
限制性内切核酸酶—— “分子手术刀”
DNA的粗提取及鉴定
提取生物大分子的基本思路：
选用一定物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质生物大分子。
DNA的粗提取及鉴定
DNA的粗提取及鉴定
1. 提取DNA的方法（提取DNA的基本思路）
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2. 实验原理
DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高
DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
实验组
对照组
水浴加热
DNA的粗提取及鉴定
3. 实验过程
第一步
选材
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
第二步
研磨
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨
第三步
提取上清液
研磨液过滤到烧杯中，置于4℃冰箱中，几分钟后，再取上清液（也可以通过离心处理后再取上清液）
第三步
第三步
加酒精析出
溶解与鉴定
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA
将丝状物或沉淀物溶于试管中的NaCl溶液中。然后，向试管中各加入4mL的二苯胺试剂鉴定（注意做对照实验）
DNA的粗提取及鉴定
教材P74-75
能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？
如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？
过滤能否用滤纸代替纱布？获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？
预冷酒精的目的及优点？
为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？
分析实验不明显结果产生差异的原因。

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