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(共23张PPT)
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
那么我们又如何达成这一目标呢？
阅读课本P16回答：
1、为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
2、栖热菌的筛选对我们筛选出特定微生物有何借鉴意义？
二、微生物的选择培养和计数
（一）选择培养基
1．水生栖热菌的筛选：水生栖热菌能在70～80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
2．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
目的：从众多的微生物中分离所需要的微生物
选择培养基
方法 特点 举例
利用微生物的营养特点进行选择培养 通过控制培养基的营养成分，使某种微生物能生长，其他微生物不能生长 利用只含有尿素一种氮源的培养基，可筛选出分解尿素的细菌；加入高浓度的食盐可筛选出金黄色葡萄球菌
利用某种化学物质进行的选择培养 在完全培养基中加入某些化学物质，抑制某些微生物，同时选择所需的微生物 加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌
利用培养条件进行的选择培养 改变微生物的培养条件 在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物，不加含碳有机物可分离出自养型微生物，不添加氮源可分离固氮菌
三种筛选方法的特点及举例
思考-讨论
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
讨论：
1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
该培养基只是用尿素作为唯一氮源。其他成分基本相同。
（二）微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
2、实验的具体操作：
2）土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
1）制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
1、稀释涂布平板法
是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
3）样品梯度稀释：
微量 移液器
稀释10倍菌液
101
土壤10g
在火焰旁称取土壤10g，加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，依次等比稀释，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成
取菌液：取0.1mL菌液滴加到培养基表面
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
涂布器灭菌：将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后、涂布器冷却后，再进行涂布
涂布平板：用涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
4）涂布平板操作
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
放入37℃恒温箱中培养1～2d
5）培养与观察
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
接种方法的判断？？？
平板划线法和稀释涂布平板法的区别。
比较项目 平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释
②涂布平板操作
注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环 稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以分离、纯化微生物并计数，可以观察菌落特征
缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板
项目 直接计数法 间接计数法
原理 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
计数数据 菌体本身 培养基上菌落数
缺点 不能区分死菌活菌，不适于对运动细菌的计数 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
公式 每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数 每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数÷涂布液体积×稀释倍数
结果 比实际值偏大 比实际值偏小
稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。
（三）微生物的数量测定
稀释涂布平板法注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
②为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
④分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
练习1：
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
练习2：
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
2、细菌能利用尿素的原因
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
探究.实践
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
一、基础知识：
提出问题：
1、如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌？
2、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌？
1、土壤取样
1）取样的位置：土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培养基。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌分布距地表3 8cm的土壤层。
2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
2、制备培养基
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
3、样品的稀释
测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。
4、微生物的培养与观察
30-370C温度下培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数。
二、实验设计
三、操作提示
2）无菌操作
3）做好标记
本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记
4）制定计划
对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊
1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
a、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌
b、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
c、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作
四、结果分析与评价
1、结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2、你是否获得了某一稀释度下菌落数目在30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
3、你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？
鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
思考：在以尿素作为唯一氮源的培养基微生物都是能分解尿素的吗？
不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
五、课题延伸
选择培养基
特殊成分
加入某种化学物质
目的
抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长
用途
举例
鉴别培养基
加入某种指示剂
发生特定颜色反应
分离出特定微生物
鉴别不同的微生物
用尿素作唯一氮源的培养基来筛选尿素分解菌
伊红—美蓝培养基
鉴定大肠杆菌
选择培养基和鉴别培养基
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数小结：
到社会中去
1、空气中微生物总数的检测？
2、水中细菌总数的检测？
3、牛奶中细菌的分离与计数？
4、土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数？
微生物的培养
基础知识
实验操作
结果分析与评价
培养基
定义：
分类：
无菌技术
定义：
消毒与灭菌
常用灭菌方法
制备选择培养基
纯化酵母菌
小结

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