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第2节 微生物的培养技术及应用
教学目标
1. 概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求,进行酵母菌的纯培养。
2. 阐明微生物选择培养的原理。
3. 进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
从社会中来
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
1、微生物类群
原核生物:
真核生物
非细胞类：
细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体
酵母菌、霉菌、食用菌
真菌：
原生生物：
显微藻类（如衣藻）、原生动物（如：草履虫、变形虫等）
病毒、类病毒（只有RNA）、朊病毒（只有蛋白质）
微生物结构简单、个体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。
温故知新
培养微生物需要解决的两个问题是什么？
（1）为微生物提供合适的营养和环境条件
培养基
　无菌技术(获得纯净培养物）
（2）确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来
2、实验室培养微生物条件
1.何为培养基？
3.不同的培养基有不同的配方，但是其基本成分都相同，都包括哪些营养元素？有何作用？请举例说明。
阅读教材P9~10相关内容，回答以下问题：
2.按照不同的培养基划分标准，培养基有哪些种类、配制特点及其应用？
（一）培养基的配制
一、微生物的基本培养技术
1、培养基概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
3、培养基类型：
2、培养基的作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物
（ ①提供微生物繁殖所需各种营养，②异养微生物的能源）
依据 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分 天然培养基
合成培养基
用途
鉴别培养基
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
半固体培养基：
无动力
有动力(弥散)
固体培养基：菌落
工业生产
观察微生物的运动、分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
长有酵母菌菌落
基础培养基
鉴别培养基
含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质
将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来
在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同类型微生物的培养基
选择培养基
培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需的微生物的生长
例如：伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌
（菌落呈深紫色，并带有金属光泽）
培养基 分离得到
加入青霉素 酵母菌和霉菌
加入高浓度的食盐 金黄色葡萄球菌
以尿素作为唯一氮源 分解尿素的细菌
不添加氮源 固氮微生物
各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求
4．培养基的营养组成
（1）基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
1）碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
2）氮源：
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
有机C源为异养型微生物提供碳源和能源
含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
特殊营养物质：
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
例如:培养乳酸菌要添加维生素；培养霉菌要调至酸性；培养细菌要调至中性或弱碱性 ；培养厌氧微生物要提供无氧条件。
（2）还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、O2的需求
C
２.自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是( )
A．碳源
B．氮源
C．无机盐
D．特殊营养物质
A
1、
当堂练习：
2.何为无菌技术？无菌技术包括哪些方面？
3.什么是消毒？灭菌？两者有何区别？
4.常用的消毒与灭菌的方法有哪些？有何要求？
5.比较干热灭菌法和湿热灭菌法的异同。
（二）无菌技术
阅读教材P10-P11相关内容，回答以下问题：
1.获得纯净微生物培养物的关键是什么？
2、无菌技术的概念
无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
1、获得纯净微生物培养物的关键：
防止杂菌污染
3、方法：
主要包括消毒与灭菌
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物 使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌
适用对象 操作空间、双手等 培养微生物的器皿、接种用具和培养基等
（1）常用的消毒方法
①煮沸消毒法：日常生活（餐具、食品等）常用100℃煮沸5-6min。可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢
②巴氏消毒法：不耐高温的液体，如牛奶 ： 62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min。
③化学药剂消毒法：用75%酒精擦拭双手；氯气消毒水源
④紫外线消毒法：
接种室、接种箱、超净工作台用紫外线照射30 min
芽孢，是细菌休眠体；含水量极低，抗逆性强，能经受高温、紫外线，电离辐射以及多种化学物质灭杀
在照射前适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果
孢子是某些微生物的繁殖体。
（2）灭菌的方法：
①灼烧灭菌：酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可迅速彻底灭菌
对象：接种工具如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，以及接种过程中的试管口、瓶口等易被污染部位
对象：耐高温，需保持干燥的物品，如玻璃器皿 (如试管、吸管、培养皿等)金属用具（针头、镊子、剪刀等）
②干热灭菌：灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱内160-170 ℃的热空气中加热2-3h
对象：主要用于能耐高温的物品，如培养基、无菌水等
③湿热灭菌：
利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽灭菌的方法
高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121 ℃下维持15-30min
培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是(　　)
①化学消毒　②灼烧灭菌　③干热灭菌　④紫外线消毒　⑤高压蒸汽灭菌　⑥巴氏消毒法
A.⑤③②①④⑥ B.①②③④⑤⑥
C.⑥②③④①⑤ D.③④②①⑥⑤
练一练：
A
2.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？（P10）
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
旁栏思考
1. 为什么培养基需要氮源 （P10）
培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
1.培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
（三）微生物的纯培养
2.纯培养：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
3．微生物纯培养的步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
酵母菌的纯培养
探究-实践
1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
2、获得单菌落的方法：平板划线法和稀释涂布平板法
单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
3、酵母菌的纯培养步骤：包括配制培养基、灭菌、倒平板、接种和分离、培养等。
(1)制备培养基
①配制马铃薯琼脂培养基
称取去皮的马铃薯200g,切成小块,加水1000mL,加热煮沸至马铃薯软烂,用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖(也可用蔗糖代替)、15~20g琼脂,用蒸馏水定容至1000mL
②灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中,加棉塞,包上牛皮纸,并用皮筋勒紧,再放入高压蒸汽灭菌锅中,在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下,灭菌15~30 min。
将5~8套培养皿包成一包,用几层牛皮纸包紧,放入干热灭菌箱内,在160~170 ℃灭菌2 h。
③倒平板
待培养基冷却至50 ℃左右时,在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操作步骤如下。
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
倒平板操作的注意事项
(1)培养基灭菌后需要冷却至50 ℃左右时才能倒平板。温度过高,培养基凝固后皿盖上冷凝水过多,落入培养基,造成污染;温度过低,培养基又会凝固。
(2)将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,不要完全打开,以免杂菌污染培养基。
(3)培养基冷却凝固后,要将培养皿倒置的原因:防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
(4)在倒平板的过程中,如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,这个平板应弃用,因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
(5)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行,避免杂菌污染
(2)接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养,可以分离得到单菌落。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散或稀释
生长繁殖
连续划线法
分区划线法
“平板划线”实验操作
1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
2、在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞
4、将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
平板划线法操作步骤：
3、将试管口通过火焰
5、将试管通过火焰，并塞上棉塞
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连
1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
分区划线法
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
平板划线法注意事项:
问题探讨
1、为什么在蘸取菌液以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
（1）操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；
（2）每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，最终能得到单个细菌繁殖而来的菌落。
（3）划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
3、在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（3）培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h.
结果分析与评价
1、未接种的培养基表面是否有菌落生长，如果有，说明了什么？
2、在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了菌落？这些菌落的颜色、形状、大小是否一致，如果你观察到了不同形态的菌落，可能是哪些原因引起的？
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染
如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的
思维训练
评估论点的可信程度
评估“水果酵素”的功效是否真实？ P14阅读讨论
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质,食用后可能会危害人体健康。因此,“吃水果‘酵素’可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
可以通过查阅专业学术期刊上发表的有关研究论文，或亲自检测水果“酵素”中的成分，获取科学可靠的证据进行全面论证。
练习
1、关于平板划线操作的叙述,错误的是(　　)
A.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B.每次划线前,灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种环上残留的菌种
C.第二次划线时,接种环上的菌种直接来源于菌液
D.划线结束后,灼烧接种环,能及时杀死接种环上的菌种
C
2、(多选)微生物接种的方法很多,平板划线法是常用的一种。如图是平板划线示意图,划线的顺序为①②③④。下列相关叙述错误的是(　　)
A.划线操作时,将蘸有菌种的接种环插入培养基
B.平板划线后培养微生物时要倒置培养
C.可以将第④区域的划线与第①区域的划线相连
D.在第②~④区域中划线前都要对接种环进行灭菌
AC
练习与应用（P14）
一、概念检测
1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
(1) 培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利 (2) 消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。( )
(3) 微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物
2. 日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
x
x
√
日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
二、拓展应用
1. 某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入 37℃恒温培养箱中培养24 h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析冋答下列问题。
(1) 这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有_____。
培养皿和培养基。
(2) “将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
接种。
(3) 从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
2：某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为210 r/min、 230 r/min和 250r/min，培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
(1) 摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
意味着培养液中O2含量不同。
(2) 从图中数据你可以得出什么结论？其原因是什么？
培养液中O2含量越高,酵母菌种群密度越大。
(3) 为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定？
这时候已经达到了环境容纳量。

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