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(共22张PPT)
DNA 的粗提取和鉴定
高中生物选择性必修三
第一节
实验原理
分离 DNA
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
提取 DNA
DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中的溶解度不同，它能溶于 2mol/L 的 NaCI 溶液。
鉴定 DNA
在沸水浴条件下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
实验设计
一
实验材料的选取
二
破碎细胞，获取含DNA 的滤液
三
除去滤液中的杂质(纯化)
四
DNA 的析出与鉴定
材料选取
从下列材料中选取 2～3 种：
菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜
鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞
在液体培养基中培养的大肠杆菌
植物材料
动物材料
微生物
材料选取
选用新鲜的鸡血时，注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固。
不能选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核。
遵循原则
注意事项
凡是含有 DNA 的生物材料都可以考虑。
但是，选用 DNA 含量相对较高的组织，成功的可能性更大。
破碎细胞，获取含 DNA 的滤液
动物细胞的破碎较容易。比如在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。
动物
细胞
动物细胞和植物细胞的结构不同，所以在破碎细胞的方法上也不同。
水分大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，而搅拌加速了鸡血细胞的破裂 (细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出 DNA。
破碎细胞，获取含 DNA 的滤液
植物细胞
提取洋葱 DNA 时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
植物细胞需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜。
加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
破碎细胞，获取含 DNA 的滤液
洗涤剂
食盐
洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于 DNA 的释放。
食盐的主要成分是 NaCl，有利于 DNA 的溶解。
如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
思考·讨论
这个步骤过滤获得什么？
Q1
Q2
滤液中可能含哪些细胞成分？
获得含核物质的滤液（获取含DNA 的滤液）。
此时释放出来的大量 DNA 和RNA 往往与蛋白质结合在一起，应用3~4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。
注意：应沿一个方向快速搅拌，不能过快过猛，防止打碎 DNA 。
可能含有核蛋白、多糖和 RNA 等杂质。
为了纯化提取的 DNA 需要将滤液作进一步处理。
除去滤液中的杂质
在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为 2mol/L，再过滤。
再用 2mol/L 的 NaCl 溶液
溶解
DNA。
右图所示为 DNA 在 NaCl 溶液中的溶液度的变化曲线。
下面是除去滤液杂质的步骤：
加蒸馏水，调节 NaCl 溶液浓度0.14mol/L
目的：
除去不溶的杂质。
目的：
析出DNA，除去杂质。
目的：
除去滤液中的杂质
为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
1. 用 2 mol/L 的NaCl 溶液溶解 DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；
2. 用 0.14 mol/L 的NaCl 溶液使 DNA 析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。
反复溶解与析出DNA，就能除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
除去滤液中的杂质
根据蛋白质的特性（如能被酶分解，高温下变性），还有没有其他除杂质的方法？
方法二
方法三
直接在滤液中加入嫩肉粉，反应 10~15 min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。
利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开。
将滤液放在 60~75 ℃ 的恒温水浴箱中保温10~15 min，注意严格控制温度范围。
利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，与DNA分离。
DNA 的析出
操作
加入与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数95％)，静置 2~3 min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的 DNA。
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min 的转速下离心 5min，弃上清液，将管底的沉淀物晾干。
用冷却的酒精提取的 DNA
DNA 的析出
为什么要用冷却的酒精溶液（体积分数95％) ，普通的酒精不行吗？
作 用
一是抑制 DNA 水解酶活性，防止 DNA 降解。
二是低温有利于增加 DNA 分子柔韧性，减少断裂。
DNA 的鉴定
取两支 20 mL的试管，各加入 2mol/L 的 NaCl 溶液 5mL。
将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。
然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。
混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入DNA的试管
空白对照
淡蓝色
思考
可以单独用甲基绿鉴定某种物质是否是 DNA 吗？
不可以。
甲基绿同样会和 RNA 结合呈绿色。
注意事项
1. 以血液为实验材料时，每 100ml 血液中需要加入 3g 柠檬酸钠，防止血液凝固。
4. 二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
2. 加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。
3. 加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧 DNA 分子的断裂，导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀。
注意事项
二苯胺试剂的配置及其使用方法
称取 1.5 g 二苯胺，溶于 100ml 冰醋酸中。
再加入 1.5ml 浓硫酸，用棕色瓶保存。
临用前，在 10 ml 的上述溶液中再加入 0.1 ml 体积分数为 0.2% 的乙醛溶液。
结果分析与评价
观察提取的 DNA 颜色，如果不是白色丝状物，说明 DNA中的杂质较多。
二苯胺鉴定出现蓝色，说明实验基本成功。如果不呈现蓝色，可能所提取的 DNA 含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。
本实验提取的 DNA 粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
分析DNA中的杂质
第二次
第三次
细节归纳
本实验中有三次过滤，分别获得了什么？
第一次
过滤用蒸馏水稀释的鸡血细胞液
获得含核物质的滤液
过滤含粘稠物的0.14mol/L NaCl溶液
过滤溶有DNA的2mol/LNaCl溶液
获取附着在纱布上的DNA 粘稠物
得到含 DNA 的滤液
第二次
第三次
细节归纳
实验中有五次用玻璃棒搅拌，分别有什么作用
第一次
搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液
加速鸡血细胞的破裂，释放DNA
搅拌加 2mol/L NaCl 溶液的滤液
搅拌加蒸馏水至0.14mol/L NaCl溶液
使DNA充分溶解
稀释 NaCl 溶液，析出 DNA 黏稠物
第四次
搅拌放入2mol/L NaCl溶液中纱布上的粘稠物
第五次
搅拌体积分数为95%的酒精溶液
第二次
第三次
第一次
搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液
加速鸡血细胞的破裂，释放DNA
搅拌加 2mol/L NaCl 溶液的滤液
搅拌加蒸馏水至0.14mol/L NaCl溶液
使DNA充分溶解
稀释 NaCl 溶液，析出 DNA 黏稠物
使 DNA 溶解
卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA
细节归纳
造成实验现象不明显的原因，分析：
1. 材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
2. 加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA 被破坏。
3. 二苯胺配制时间过长，变成浅蓝色，影响鉴定效果。
4. 析出含DNA的黏稠物时，蒸馏水一次快速加入，影响实验结果。
5. 实验中有多次搅拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作时不注意区分，影响实验结果（注意：搅拌都沿一个方向进行）。

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