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第二节
动物细胞融合技术与单克隆抗体
第二课时
01.
核心素养
社会责任：
认同单克隆抗体在临床上具有重要应用价值。
科学探究：
概述单克隆抗体的制备，举例说出诱导动物细胞融合的方法。
生命观念：
单克隆抗体的制备和过程。
02.
课标要求
阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程。
认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。
一、动物细胞融合技术
我们知道，运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。
那么，有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？
19 世纪 30 年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
后来研究发现：病人体内的病毒等因素诱导了多个体细胞融合形成了多核细胞。
什么是动物细胞融合？
动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
动物细胞
融合
1.诱导原理
细胞膜的___________。
2.诱导结果
形成 细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。
流动性
杂交
动物细胞融合的诱导方法有哪些？
_______法、电融合法和__________________法等。
3.诱导方法
PEG
灭活病毒诱导
是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
灭活
生物法
灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
红绿荧光染料标记的BHK-21细胞在HVJ-E存在下于37℃孵育
4.动物细胞融合的过程包括
细胞膜融合、
细胞质融合、
细胞核融合
细胞膜融合是细胞融合的先导，在细胞膜融合中，体现出细胞膜具有一定的流动性，细胞融合的实质是核融合。
动物细胞融合完成的标志：
两个或多个细胞核融合为一个细胞核。
5.动物细胞融合技术的应用
1.这一技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
2.特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
6.动物细胞融合技术的意义
细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
课标要求
植物体细胞杂交与动物细胞融合技术的比较
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
使用的酶
诱导方法
诱导原理
诱导结果
意义
纤维素酶和果胶酶去除细胞壁
胰蛋白酶或胶原蛋白酶
物理（离心法、电融合法）
化学（聚乙二醇融合法）
物理和化学方法
灭活的病毒（生物法）
细胞膜流动性、细胞全能性
细胞膜的流动性
获得杂种植株
获得杂交细胞
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
二、单克隆抗体及其应用
早期人们为了获得抗体，就向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
用这种方法制备的抗体：（缺点）
产量低
纯度低
特异性差
研究发现
哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的 B 淋巴细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。
动物体内产生的特异性抗体的种类可多达百万种以上，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
研究发现
要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的 B 淋巴细胞，形成细胞群。
产生问题
在体外培养条件下，一个B 淋巴细胞是不可能无限增殖的。
杂交瘤细胞
单克隆抗体大量制备
抗体
科学设想
1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的实验方案：
把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够的特定抗体。
产生的特定抗原的抗体，就是单克隆抗体。
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
(属于癌细胞)
+
细胞 融合
单克隆抗体
用_________________进行_______繁殖，也就是通过_____形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出_________________________的抗体，即单克隆抗体。
概念
单个B淋巴细胞
无性
克隆
化学性质单一，特异性强
B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能_____________又能产生大量____________。
无限增殖
特定抗体
原理
制备过程
用特定的抗原对小鼠进行免疫，从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的___________。
B淋巴细胞
1.注射特定的抗原
1.培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞是一种________，有____________的能力。
注射特定的抗原
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
培养骨髓瘤细胞
癌细胞
无限增殖
制备过程
2.诱导细胞融合
将骨髓瘤细胞与 B 淋巴细胞融合
+
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导 融合
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
将_____________________与_____________________融合。
常用方法有PEG融合、电融合和灭活病毒诱导法等。
制备过程
3.特定的选择培养基来筛选
多种杂交细胞
将骨髓瘤细胞与 B 淋巴细胞融合
杂交瘤
死亡
杂交瘤细胞
第二次筛选
第一次 筛选
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的
细胞才能生长。
在这个过程中，有两次筛选，有何区别？
制备过程
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选原因
筛选方法
筛选目的
诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞
从小鼠体内提取的B淋巴细胞有多种，形成的杂交瘤细胞也有多种
特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下，开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群
获得杂交瘤细胞
获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
制备过程
对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行________________和_____________，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需_______的细胞。
杂交瘤细胞
克隆化培养
抗体检测
抗体
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞，分泌的抗体能与特定抗原结合。
阳性
阴性
杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生抗体。
制备过程
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在 条件下大规模培养，或注射到小鼠 内增殖。
阳性杂交
瘤细胞
注射到小鼠腹腔内
单克隆抗体
体外培养
方法①
方法②
获 得
获 得
4.培养方法
体外
腹腔
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
5.单克隆抗体的获取
制备过程
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
结果 获得单克隆抗体 获得单克隆抗体
易于控制培养条件，成本较低
可大规模培养，大量生产
规模小，产量低
需要认为控制培养条件，成本相对较高
单克隆抗体
能准确地识别_________的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量_________。
优点
抗原
制备
诊断试剂
治疗疾病
运载药物
应用
(1) 作为_____________，在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要的作用。 具有准确、高效、简易、快速的优点。
(2) 用于______________和______________。
单克隆抗体的应用
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体定位下的肿瘤
单克隆抗体除运载药物外，自身也能用于治疗疾病。
2015年，全球销售额排名前十位的药物中，单克隆抗体药物就有5种。同年，我国的单克隆抗体药物市场规模已达72亿元。
单克隆抗体的应用
用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在 90% 以上。
单克隆抗体的应用
使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。
抗体一药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC 通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
单克隆抗体的应用
思考 · 讨论
ADC 的抗体和药物各具有什么作用
Q1
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
Q2
除细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。
一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上可将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
思考 · 讨论
单克隆抗体诊断试剂盒和 ADC 在临床应用上各具有什么优势
Q3
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高。生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。
ADC 能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
血清抗体与单克隆抗体的比较
血清抗体
单克隆抗体
产生
特点
由 B 淋巴 (浆)细胞分泌
一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差
由杂交瘤细胞分泌
特异性强、灵敏度高，能大量制备
当堂检测
下列关于单克隆抗体制备的说法，正确的是(　 　)
A. 将特定抗原注射到小鼠体内，可以从小鼠血清中获得单克隆抗体
B. 经特定抗原免疫过的B淋巴细胞在体外培养时可分泌单克隆抗体
C. 诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，发生融合的细胞均为杂交瘤细胞
D. 筛选出杂交瘤细胞后，需利用特定抗原再次筛选分泌单克隆抗体的细胞
Q1
D
当堂检测
下图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT－)，在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。叙述不正确的是(　 　)
Q2
B
A．可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合
B．两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长
C．杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产
D．细胞膜的流动性是细胞融合的基础
当堂检测
Q3
有关动物细胞融合的叙述不正确的是（ ）
A. 使远缘杂交成为可能
B. 杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息
C. 其基本原理是细胞膜的选择透过性
D. 为制造单克隆抗体开辟了新途径
C
动物细胞融合属于动物细胞工程技术手段之一，下列有关动物细胞融合叙述正确的是（ )
当堂检测
Q4
A. 动物细胞融合产生的细胞称为重组细胞
B. 融合后形成的细胞为单核或多核细胞
C. 常用的诱导融合的生物诱导剂是聚乙二醇、灭活的病毒等
D. 也称细胞杂交，可由两个或多个动物细胞结合成一个细胞
D
当堂检测
Q5
用动物细胞工程技术制各单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是（ ）
A. 将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞
B. 用氯化钙作诱导剂，促使能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合
C. 筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体
D. 该杂交瘤细胞的增殖方式和产物分别是有丝分裂和单克隆抗体
B

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