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(共36张PPT)
第2节 微生物的培养技术及应用
一、微生物的基本培养技术
确保其它微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来
微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。
衣藻
1. 微生物：
微生物的基本培养技术
大肠杆菌
酵母菌
毛霉
草履虫
新冠病毒
为微生物提供合适的营养和环境条件
培养基
无菌技术
2.在实验室培养微生物的基本思路：
一、培养基的配制
1. 培养基的定义
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出其生长繁殖的营养基质叫做培养基。
① 培养、分离、鉴定、保存微生物。
② 积累其代谢物。
2. 培养基的用途
① 分类依据：
物理性质
3. 培养基的种类
一、培养基的配制
4. 培养基的基本成分
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 水
基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、O2 的需求。
乳酸杆菌
霉菌
细菌
厌氧微生物
特殊营养物质：
维生素、氨基酸、生长因子等
培养基中添加维生素
培养基pH调至酸性
提供无氧的条件
培养基pH调至中性或弱碱性
不加碳源的培养基用来培养 微生物
不加氮源培养基可用来培养 微生物
①碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
②氮源：
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
自养
固氮
思考：
含C、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能量。
1.同一种物质能否既做作碳源又做氮源？
2.碳源都可以提供能量？
CO2是自养微生物的碳源，但不提供能量。
琼脂是一种多糖，但不能作为碳源，只能作为凝固剂。
C
训练巩固：
二、无菌技术
消毒
灭菌
无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术应围绕着如何避免杂菌污染展开。
使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药物消毒法
紫外线消毒
1. 消毒
100℃煮沸5~6min。
可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
62~65℃煮30min或80~90℃下处理0.5~1min。可杀死绝大部分微生物，不破坏食物的营养成分。
用70%酒精擦拭双手、
用氯气消毒水源等。
对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。
二、无菌技术
用强烈的理化方法杀死物体内外的所有的微生物，包括芽孢和孢子。
某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的抗逆性强的休眠体。芽孢萌发可形成细菌体。
芽孢
孢子
2. 灭菌
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞，能直接发育成新个体。
芽孢和孢子具有高度的耐热性，可抗化学药物和抗辐射。
①湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方式
高压蒸汽灭菌锅
三、无菌技术
高压蒸汽灭菌法（效果最好）：
100kPa、121℃下维持15-30min。常用于培养基、无菌水等的灭菌。
三、无菌技术
灭菌的方法：
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器)
金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热1-2h
干热灭菌箱
③灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧
对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位
A
训练巩固：
三、微生物的纯培养
1.纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
2.纯培养：获得纯培养物的过程。
　酵母菌的纯培养实例
1. 实验原理
①分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
念珠菌显色培养基
金黄色葡萄球菌和枯草杆菌
②采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
1. 实验原理
稀释涂布平板法
平板划线法
微生物纯培养过程：
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养
4、步骤
（1）制备培养基
配置培养基（P12）
定容完成后调节培养基的pH
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞
包上牛皮纸，并用皮筋勒紧
压力100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15 ~ 30min
取5 ~ 8套培养皿
培养皿叠成一束
用几层牛皮纸包紧
放入干热灭菌箱内，160 ~ 170℃灭菌2h
4、步骤
（1）制备培养基——灭菌
拔出锥形瓶的棉塞
将瓶口迅速通过火焰
用拇指和食指将培养皿打开
一条稍大于瓶口的缝隙，将
培养基（10 ~ 20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒置
待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
灼烧灭菌
倒平板
1.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
3.如何确定所倒平板未被杂菌污染或灭菌是否彻底？
2.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
①防止培养基表面的水分过快挥发；
②防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。
酵母菌的纯培养
合作研讨：
2. 接种和分离酵母菌
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
培养
1
2
3
4
5
1）方法
平板划线法 : 通过接种环在固体培养基表面连续划线操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
工具：接种环
2）原理：
连续划线法
分区划线法
3）操作
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后的划线与第一次相连。
3）操作
分区划线法
平板划线法注意事项:
1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
2.划线首尾不能相接
3.每次划线前、后都要对接种环进行灼烧灭菌
4.划3个平板（重复实验），1个不划线（空白对照）
5.划线后,培养皿倒置培养
6.使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
（１）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上原有微生物。
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
（２）在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
（３）在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因？
使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，以便获得单个菌落。
合作研讨：
(4)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？
提示：培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。
1．下列有关微生物的分离与培养的叙述，错误的是(　　)
A．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染
B．倒置平板可防止培养皿皿盖上的冷凝水滴落造成污染
C．倒平板时将培养皿的皿盖拿开，以便于将锥形瓶中的培养基倒入培养皿 D．检验培养基是否被杂菌污染的最有效方法是将未接种的培养基放在恒温培养箱中培养
2．在分离、纯化酵母菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如
图所示，且甲、乙的对应位置不变。有关叙述错误的是(　　)
A．配制培养基时需进行高压蒸汽灭菌
B．甲中a区域为划线的起始位置
C．连续划线的目的是获得单个微生物繁殖形成
的菌落
D．图示接种过程中接种环灼烧了5次
B
C
第1章 第2节
人教版 选择性必修3
一、选择培养基
1.定义：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2.举例：
①加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌；
②缺乏氮源的培养基，可分离自生固氮微生物；
③缺乏有机碳源的培养基，可分离自养微生物；
④石油为唯一碳源的培养基，分离出能降解石油的微生物；
⑤高盐培养基，可分离耐盐微生物。
培养基分类依据：用途
选择培养基
鉴别培养基
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)
目的 抑制其他微生物的生长，促进目标微生物的生长 微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色)
鉴别培养基
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
【答】设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。
1.在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
【答】葡萄糖提供碳源；尿素提供氮源。
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
【答】这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15g
H2O 定容至1000mL
3.该选择培养基的原理是什么？
【答】只有能够以尿素作为氮源的细菌才能在该培养基上生长。
4.如何确定该选择培养基具有选择作用呢？
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15g
H2O 定容至1000mL
思考：
能否用平板划线法统计分解尿素的细菌的数量？
1.稀释涂布平板法
稀释涂布平板法计数的原理：
当样品的稀释度足够高时，一个单菌落来源于一个活菌。
思考：哪一个稀释倍数适合计数？为什么？
为了保证结果准确，一般选择菌落数为30-300的平板进行计数。
102
103
104
105
106
已接种的稀释不同倍数的的选择培养基
思考：你能计算出每克土样中分解尿素的细菌数吗？
菌落数 52
菌落数 63
菌落数 77
105
每g样品中的菌落数＝
(64÷0.1)×105
=6.4×107个
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
思考：你认为这两位同学的实验需要改进吗 如果需要，如何改进
思考：你觉得这种方法计算结果比实际值偏大还是偏小？
统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
微生物计数方法，除了稀释涂布平板法之外，还有显微镜直接计数法。
显微直接计数法统计的菌落数往往偏大，这是因为显微镜下不能区分死菌与活菌。
显微直接计数法
思考：该方法计数的结果和稀释涂布平板法计数的结果有什么区别？为什么？
工具：细菌计数板或血细胞计数板。
尿素分解菌的初步筛选后，要作进一步的鉴定：
原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，使培养基的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可以进一步鉴定该种细菌能够分解尿素。
课题延伸
菌种保存

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