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第三章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
1944年
1953年
1961年
1970年
1972年
1973年
基因工程的诞生和发展
桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
证明质粒可以作为基因工程的载体，使外源基因在原核细胞中成功表达，实现物种间基因交流，基因工程正式问世。
艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
发现质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（限制酶）。
1967年
1977年
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
分析：
人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质（胰岛素）的理论基础：
（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是 。
（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，原因是____________________________________________________________
（3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为：
_________________________________________________________
（4）遗传信息的传递都遵循 。
(5) 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
DNA
中心法则
基因的碱基种类、空间结构和碱基互补配对方式相同
所有生物共用一整套遗传密码
科技探索之路
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位
② 遗传信息的传递都遵循中心法则 ③ 生物界共同一套遗传密码
基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术
1.操作环境：
2.原理：
3.操作对象：
4.操作水平：
5.结果：
体外环境
基因
DNA分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
科技探索之路
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
6.意义：
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
到社会中去
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）
到社会中去
实现这一精确的操作过程，至少需要三种“分子工具”
工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶
DNA连接酶：
载体：
准确切割DNA分子,得到所需的目的基因
能将目的基因连接到载体上
能将目的基因导入受体细胞中
培育转基因番木瓜过程：
资料卡
限制酶名字的由来（72页）
限制酶是如何命名的呢？一般是用生物属名的头一个字母与种名的头两个字母，组成了3个字母的略语；第四个字母表示菌株(品系）。以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如，一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind III
Hind I
Hind II
A
T
G
C
一.限制性内切核酸酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物体内分离纯化出来的
（2）功能：能够识别双链DNA分子的特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键（脱氧核苷酸之间）断开，因此具有专一性。
磷酸二酯键
断开部位
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamHⅠ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
TaqⅠ
5’ ……T-C-G-A……3’
3’ ……A-G-C-T……5’
大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，少数由___个、__个或_________的核苷酸组成。
6
4
8
其他数量
注意：
(1)
从5’→3’读
(2)一般都是回文序列
(3)可找到中心轴线
EcoR I
(在G与A之间切割)
Sma I
(在G与C之间切割)
5'
5'
5'
5'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
一.限制性内切核酸酶（限制酶）
黏性末端
平末端
A.形成的黏性末端（从5’往3’读）为_________
B.一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键形成 ___个黏性末端
C.同一种限制酶切割形成的黏性末端_______（可旋转180°比较）
AATT
两
相同
DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者DNA分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开
限制酶存在于原核生物中的作用是什么
限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA
原核生物容易受到外源DNA的入侵
限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效
保证自身的安全
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，靠DNA连接酶来完成。，
注意: DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA；也不能连接RNA！
二.DNA连接酶
T4 DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。
T4 DNA连接酶的缝合作用
二、重组DNA技术的基本工具--DNA连接酶
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
(1)作用:
(2)分类
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点
大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
二.DNA连接酶
三、基因进入受体细胞的载体
（1）来源：来源于 等生物，最常用的是大肠杆菌质粒。
1.最常用的载体——质粒
细菌和酵母菌
（2）实质：它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的 （化学本质），故质粒有 　 个游离的磷酸基团。
双链环状DNA分子
0
（3）作用:
①　　　　　　　　　　　　　　　　．
②　　　　　　　　　　　　　　　 　．
将目的基因转移到受体细胞中去
在受体细胞内对目的基因进行大量复制
（4）质粒作为载体所具备的条件
条件 原因
能自我复制（有复制原点） 使DNA数量增多
有一个至多个 ______________位点 供外源DNA片段(基因)插入其中
能在细胞中进行 到 受体DNA上 能使目的基因 且数量可扩增
常有特殊的__________ 便于重组DNA分子的_______
无毒害作用 对受体细胞 作用，避免受体细胞受到损伤
自我复制或整合
限制酶切割
标记基因
筛选
稳定存在
无毒害
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌等
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
（5）载体的种类
①λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒作为运载体利用的原理是： ____________________________________.病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 ____________________性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
物种（组织）特异
②若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是_____________________。
噬菌体
噬菌体不能侵染家蚕
③霍乱弧菌中含有质粒，但 用来做载体（有害）
不能
(1)已知EcoRⅠ的识别序列和切点是—G↓AATTC—，BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—
EcoRⅠ
BamHⅠ
③同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同； 【解析：酶具有专一性，识别的序列不同】
四、拓展补充——1.限制酶
(2)已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC—
BamHⅠ
Sau3AⅠ
同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同,(也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配对连接成链）
G
C
G
C
C
G
C
G
总结：产生相同的黏性末端不一定都是用同一种限制酶切割
四、拓展补充——1.限制酶
(3)已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC—
BamHⅠ
BamHⅠ可以断开Sau3AⅠ的识别序列吗 反之呢？
Sau3AⅠ
总结：不一定 可以 （酶的识别序列越短，断开的几率越大）
四、拓展补充——1.限制酶
用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后， 序列会明显 （增多、减少、不变）。
－AGATCC－
－TCTAGG－
增多
总结：两种同尾酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别
四、拓展补充——1.限制酶
（4）
a酶和b酶是否可以识别此序列？
不能
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA聚合酶
相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键，需要模板
旁栏思考（P72）：
四、拓展补充——2.DNA连接酶
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段，形成黏性末
端或平末端
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端，形成新的DNA分子
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
四、拓展补充——3.与DNA相关的五种酶
1.标记基因通常有:
①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)
②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低
五、拓展补充——标记基因对重组DNA分子的筛选
2、筛选含有目的基因的细菌（2种抗性基因）
(2)从抗性上说：含有目的基因的细菌有什么特点？
质粒
目的基因
重组质粒
细菌
筛选
抗氨苄青霉素，不抗四环素
氨苄青霉素抗性基因
四环素抗性基因
(1)“重组质粒”导入细菌时有哪些情况？
未导入、只导入质粒、
导入重组DNA
（3）未导入、只导入质粒的细菌有什么特点
二者均不抗
既抗氨苄青霉素也抗四环素
如何利用标记基因（氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因）对受体细胞进行筛选？
3、影印法
特点：培养基上的菌落位置相同
做法：配制三种培养基，一种是普通培养基，第二种是加入氨苄青霉素的培养基，第三种是加入四环素的培养基。
要选择能够在含有氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含有四环素培养基上生存的菌落。
如上图中的 号菌落中的细菌是含有目的基因的细菌。
普通培养基
加四环素
加氨苄青霉素
4、6
从抗性的角度分析，菌落1抗性如何，原因？
菌落2、3、5的抗性如何，原因？
菌落2、3、5导入的质粒不含有目的基因（即空质粒）。
寻根问底
加四环素
加氨苄青霉素
普通培养基
菌落1，未导入质粒。
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
六、重组DNA分子的模拟操作（73页）
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GCCGTATG…
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GCCGTATG…
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
重组DNA分子的模拟操作
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GCCGTATG…
用同种限制酶切割，容易出现质粒和目的基因自身环化。
使用一种限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
问题探讨
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
讨论：
4.重组质粒的形成中，用何种酶处理目的基因和载体（质粒）？
用相同的限制酶处理目的基因和运载体，获得相同的末端，然后用DNA连接酶对其进行连接。
5.得到的产物一定是目的基因和载体结合形成的重组DNA吗？
由于用同种限制酶切割，会产生相同黏性末端，则可能导致目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。
6.为了避免上述情况发生，可采取的措施是什么？
进行双酶切。即用两种酶同时切割目的基因和载体。
(目的基因和载体均得到末端1和末端2，其中1与1结合，2与2结合）
1.实验思路：
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
2.实验原理：
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
七、DNA的粗提取与鉴定（74页）
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA（可以用鸡血细胞）。
3.选材：
注意：
4.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
DNA的粗提取与鉴定
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
117页附录2
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
研磨的目的:
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
5.DNA的粗提取与鉴定步骤：
2．去除滤液中的杂质
方案一
方案二
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
低温放置几分钟的作用？
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂；使DNA易形成沉淀析出。
1.取材、研磨：
3.DNA的析出
方案一
方案二
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
搅拌时应轻缓、并沿一个方向？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
4.DNA的鉴定
实验组
对照组
水浴加热
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。
混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
蓝色
（5）方法步骤小结：
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
在上清液中加入体积相等的、____________溶液，静置2-3min，溶液中出现的______________就是粗提取的DNA 。
将丝状物或沉淀物溶于_________________溶液中，加入___________试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
2.去除杂质
3.DNA的析出
4.DNA的鉴定
1.破碎细胞
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
二苯胺
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
2mol/L的NaCl
洋葱
研磨液
DNA的粗提取与鉴定视频
实验结果不明显的可能原因
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
结果分析与评价
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
进一步探究（75页）
本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。
例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
DNA的粗提取与鉴定
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 噬菌体、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位： 磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针
C
A
课堂练习
二、拓展应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
迄今为止。在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
课堂练习
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaI。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
课堂练习
谢谢！

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