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第57课时
微生物的培养技术与应用
1.通过配制培养基、灭菌、接种和培养等实验操作获得纯化的酵母菌菌落。
2.分离土壤中分解尿素的细菌，并进行计数。
课标要求
考情分析
1.微生物的基本培养技术 2023·全国乙·T37　2022·天津·T3　2021·天津·T1
2.微生物的选择培养和计数 2023·山东·T15　2023·广东·T10　2023·北京·T16　
2022·全国甲·T37　2022·全国乙·T37　2022·广东·T21　
2021·江苏·T18
内容索引
考点一　　微生物的基本培养技术
考点二　　微生物的选择培养和计数
课时精练
考点一
微生物的基本培养技术
1.培养基的配制
(1)培养基的概念、用途和类型
①概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出的供其______
______的营养基质。
②用途：用以 微生物或积累其 。
营养物质
生长
繁殖
培养、分离、鉴定、保存
代谢物
③培养基的种类(按物理性质分)
培养基种类 培养基特点 作用
_____培养基 加凝固剂，如_____ 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定
_____培养基 不加凝固剂 常用于工业生产、微生物的扩大培养
固体
琼脂
液体
(2)培养基的配方
①主要营养物质：水、 、氮源、 。
②其他条件：pH、 和氧气。如表：
碳源
无机盐
特殊营养物质
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物
特殊需求 添加______ 一般pH调至____ 一般pH调至____ _________ _____
维生素
酸性
无氧
或弱碱性
中性
2.无菌技术
(1)目的：获得 的微生物培养物。
(2)关键：防止 污染。
纯净
杂菌
(3)消毒与灭菌的比较
项目 消毒 灭菌
作用强度 较为_____的理化因素 ______的理化因素
作用程度 杀死物体表面或内部______微生物 杀死物体内外_____的微生物
芽孢和孢子 一般不能杀灭 能杀灭
适用对象 实验操作的空间、操作者的衣着和双手 微生物培养的器皿、接种用具和培养基等
常用方法 ______消毒法、_____消毒法等 _____灭菌法、_____灭菌法、_____灭菌法等
温和
一部分
强烈
所有
煮沸
巴氏
湿热
干热
灼烧
(4)注意事项
①实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与 接触。
②为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在_____________附近进行。
周围的物品
酒精灯火焰
3.微生物的纯培养概念辨析
固体培养基
一定形态结构
4.纯培养的过程(以酵母菌为例)：包括_______________________
___________等步骤。
(1)制备培养基
倒平板注意事项：a.温度：50 ℃左右；b.操作：在 附近；c.冷凝后平板倒置。
配制培养基、灭菌、接种、分离和培养
湿热灭菌法
酒精灯火焰
提醒　平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快挥发。
(2)接种和分离酵母菌
①平板划线法的原理：通过 在固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步 到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到 。
接种环
连续划线
稀释分散
单菌落
②平板划线法的操作步骤
(3)培养酵母菌
将接种后的平板和一个 的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养24～48 h。
未接种
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质(　　)
(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　　)
提示　倒平板时，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将锥形瓶中的培养基(10～20 mL)倒入培养皿，立即盖上培养皿的皿盖，不能打开皿盖。
√
×
(3)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(　　)
提示　接种环灼烧灭菌后，应冷却后再挑取菌落，以免高温杀死菌种。
×
(4)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和灭菌(　　)
提示　对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
×
发酵生产啤酒的过程中，杂菌产生的微量副产物是啤酒“上头”的原因之一，可采用平板划线法对酵母菌进行纯化。如图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题：
(1)用图中字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤：________________
_______。
d→b→f→a→e→c
→h→g
(2)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
提示　需要；划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。
(3)在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
提示　划线后，线条末端菌种的数
目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(4)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？
提示　培养未接种的培养基的作用是对照，未接种的培养基经过培养后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。
考向一　微生物的基本培养技术
1.(2022·湖北，4)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是
A.动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B.微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C.为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D.可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
√
1
2
动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；
动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，但微生物的培养不能加入抗生素，因为抗生素会杀死某些微生物，B错误；
一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，防止杂菌污染，C错误。
1
2
2.(2020·江苏，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是
A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从
Ⅲ区挑取单菌落
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌
种纯化的目的
D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
1
2
√
温度降低后，培养基易凝固，因此倒平板后要及
时轻轻晃动，以保持均一性，A错误；
由题图可知，随着划线次数增多，细菌密度逐渐
减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；
菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C错误；
刚果红能与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D错误。
1
2
返回
考点二
微生物的选择培养和计数
1.区分选择培养基与鉴别培养基
种类 特点 用途 举例
选择培养基 允许______________________，同时______________________ ___________ 从众多微生物中分离所需的微生物 以尿素为唯一氮源的培养基分离得到尿素分解菌
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌
特定种类的微生物生长
抑制或阻止其他种类微
生物生长
提醒　常见选择培养基举例：(1)缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。(2)含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。(3)无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2.微生物的选择培养和数量测定
(1)稀释涂布平板法步骤
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
操作步骤：
②涂布平板操作步骤
培养基
酒精
冷却
菌液
(2)微生物的数量测定方法
①显微镜直接计数法
提醒　显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，但是通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
②间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)
a.原理：当样品的稀释度 时，培养基表面生长的一个 ，来源于样品稀释液中的 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
b.计数原则：为了保证结果准确，一般选择菌落数为 的平板进行计数。
足够高
单菌落
一个活菌
30～300
c.误差分析：用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目 (填“高”或“低”)，因为_________________________________________
________________。
低
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到
的只是一个菌落
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
(1)实验原理
脲酶
尿素
(2)实验流程
3～8
30～300
稀释涂布平板
30～37
菌落数目稳定
(3)实验结果分析与评价
对照的培养皿中
对照的培养皿中
少于
30～300
(1)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数
(　　)
提示　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落，故稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
×
(2)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计(　　)
提示　统计菌落数目时为保证结果准确，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
×
(3)利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数(　　)
提示　利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离，但平板划线法不能用于微生物的计数。
×
(4)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量(　　)
提示　显微镜直接计数法不能区分细菌的死活，因此统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
×
在发酵生产啤酒过程中，要随时检测培养液中的酵母菌数量、产物浓度等，以了解发酵进程。甲、乙、丙三位同学用稀释涂布平板法测定同一培养液的酵母菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下三种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
提示　不可靠；为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
提示　不合理；微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
(3)在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
提示　作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
(4)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示　尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落特征。
(5)丙同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个
(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)，那么稀释倍数为106的试管中细菌的浓度是 个/mL。每克样品中的细菌数是 个。
2.34×103
2.34×109
考向二　目标微生物的筛选与鉴定
3.(2023·广东，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目
标菌的条件组合是
A.a点时取样、尿素氮源培养基
B.b点时取样、角蛋白氮源培养基
C.b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D.c点时取样、角蛋白氮源培养基
3
4
√
5
6
研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应在c点时取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D符合题意。
3
4
5
6
4.(2022·江苏，3)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是
A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
3
4
√
5
6
农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A正确；
为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，能合成脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。
3
4
5
6
考向三　微生物的分离与计数
5.(2024·湖北高三调研)研究者从温泉中筛选出能高效产生耐高温淀粉酶的嗜热细菌的过程如图1所示。将得到的嗜热细菌悬液转接到特定固体培养基上培养，得到若干菌落后用碘液作显色处理，结果如图2所示。下列说法错误的是
A.过程①②一般都取1 mL菌液转移
B.试管甲、乙都通过无菌水稀释
C.图2中周围不显蓝色的菌落含有
所需菌种
D.过程①②属于稀释涂布平板法，能对分离得到的微生物进行计数
3
4
√
5
6
过程①为稀释过程，一般都取1 mL菌液转移，过程②为涂布平板过程，一般取0.1 mL菌液进行涂布，A错误；
图2中周围不显蓝色的菌落产生的淀粉酶可以在高温下分解淀粉，所以周围不显蓝色的菌落含有所需菌种，C正确。
3
4
5
6
6.(2020·江苏，31)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是_____(填编号)。
3
4
编号 ① ② ③ ④
物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器
灭菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧
④
5
6
(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经__________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌___________________个。
3
4
等比稀释
4.6×105(或460 000)
5
6
3
4
利用稀释涂布平板法统计活菌数目时，需要将制备的菌悬液进行等比稀释，以获得细胞密度不同的菌悬液，一般来说，菌落数为30～300的平板最适于计数。0.1 mL菌悬液中含有46个酵母菌落，则1 mL菌悬液中含有460个酵母菌落；1.0 g土壤样品首先稀释100倍，然后稀释10倍，共稀释了1 000倍，因此样本中每克土壤约含酵母菌460×1 000＝4.6×105(个)。
5
6
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行______育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以______为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径______的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
3
4
诱变
脂肪
较大
5
6
3
4
采用射线辐照引起酵母菌基因突变，此种方法属于诱变育种。检查诱变酵母菌产脂肪酶的能力，需要把酵母菌接种到以脂肪为唯一碳源的培养基上，按照产生菌落直径大小进行初步筛选，直径大的说明产酶能力强，利用的脂肪(碳源)多，直径小的说明产酶能力弱，利用的脂肪(碳源)少。
5
6
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株___进行后续相关研究，理由是________________
___________________________________________________。
3
4
B
该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
5
6
3
4
通过分析题图可知，相同时间内，菌株B细胞密度大，说明该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；相同时间内，菌株B利用的脂肪多，脂肪剩余量少，说明该菌株降解脂肪的能力强，净化效果好。
5
6
1.(选择性必修3 P10)培养基的化学成分包括 等。
2.(选择性必修3 P11)无菌技术的选择：对于一些不耐高温的液体，如牛奶，可使用 法；用 消毒水源；培养基一般采用 法进行灭菌；培养皿可以采用 法灭菌；接种环可以采用________
法灭菌。
水、无机盐、碳源、氮源
巴氏消毒
湿热灭菌
氯气
干热灭菌
灼烧灭菌
3.(选择性必修3 P13)平板划线操作的第一步灼烧接种环是为了_________
_______________________________；每次划线前灼烧接种环是为了____
____________________________________________________________________________________________，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能___________________________________________________________。
避免接种
环上可能存在的微生物污染培养物
上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端
杀死
及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
4.(选择性必修3 P16)选择培养基是指________________________________
________________________________________________________。
5.(选择性必修3 P19)检测培养物中是否有杂菌污染的方法是____________
________________________________________。判断选择培养基是否起到筛选作用的方法是_____________________________________________
_______________________________________________________。
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
同时培养灭菌
后的未接种的培养基，观察是否有菌落产生
配制牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，观察选择培养基上的菌落数是否远少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目
6.(2023·新课标，35节选)从豆科植物的根瘤中分离根瘤菌进行培养，可以获得纯培养物，此实验中的纯培养物是 。
7.(2021·广东，21节选)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是______________________________________________________________
_________________________________________(答出两点即可)。
由根瘤菌繁殖形成的单菌落
盐浓度为60 g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
8.(2023·全国乙，37节选)在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是 。
9.(2022·河北，23节选)枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用
(填“静置”或“摇床震荡”)培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用 (填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是__________________________________________
________________________________________________________________________。
菌T能够分泌纤维素酶
摇床震荡
稀释涂布平板法
用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内
10.(2022·全国乙，37节选)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：_____
________________________________________________________________________________________________________________。
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设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，确定最适碳源浓度
课时精练
一、选择题
1.(2024·重庆高三联考)熔喷布的主要成分是聚丙烯，会对环境造成污染。某科研小组从土壤中分离到一种能分解聚丙烯的细菌。下列说法正确的是
A.配制固体培养基时，需要在无菌的环境中进行
B.制备培养基时需要先将培养基的pH调节至中性或弱碱性
C.从土壤中分离能分解聚丙烯的细菌，可采用平板划线法进行分离与计数
D.纯化培养时，在培养皿皿盖做标记后倒置在恒温培养箱中静置培养
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3
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12
√
配制固体培养基时，不需要在无菌的环境中进行，因为培养基配制好之后会进行灭菌，A错误；
平板划线法只能对微生物进行分离，不能计数，C错误；
纯化培养时，在培养皿皿底做标记后倒置在恒温培养箱中静置培养，这样方便观察，D错误。
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2.(2023·淮安高三模拟)如图为实验室中酵母菌纯培养过程的部分操作步骤，下列说法正确的是
1
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A.微生物的纯培养物就是指不含代谢废物的微生物培养物
B.步骤①中，用手触摸估计培养基冷却至室温后开始倒平板
C.步骤①使用的培养基制备过程是先调pH再灭菌
D.③到④过程中，每次划线后都需要灼烧接种环并蘸取菌液
√
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，A错误；
步骤①中，用手触摸估计培养基冷却至50 ℃左右时，开始倒平板，B错误；
③到④过程中，每次划线后对接种环进行灼烧处理，是为了杀死接种环上残留的菌种，使划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，不需要重新蘸取菌液，D错误。
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3.(2021·山东，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是
A.甲菌属于解脂菌
B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
√
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乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误。
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4.(2023·山东，15)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是
A.不含氮源的平板不能用于微生物培养
B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
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√
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不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；
平板涂布时涂布器使用前必须先浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，B错误；
使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；
脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素进行生长繁殖，D正确。
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5.(2024·咸阳高三调研)为加速我国北方冬春季秸秆原位还田的腐化过程，研究人员以冻牛粪为材料筛选出耐低温(10 ℃)的纤维素降解菌。下列相关叙述正确的是
A.选用冻牛粪为材料与其富含纤维素及含耐低温微生物有关
B.初筛菌种前，要利用固体培养基在37 ℃条件下扩大培养目标菌种
C.用于筛选的培养基是加入刚果红染料的牛肉膏蛋白胨培养基
D.应选择菌落直径与周围透明圈直径比值大的菌落进行纯化
√
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筛选耐低温的纤维素降解菌需要到其所生活的环境中寻找，冻牛粪中富含纤维素和耐低温微生物，所以选用冻牛粪为材料可筛选出耐低温的纤维素降解菌，A正确；
初筛菌种前，要利用液体培养基在10 ℃条件下扩大培养目标菌种，B错误；
用于筛选的培养基是以纤维素为唯一碳源的固体培养基，加入刚果红染料起鉴别作用，C错误；
菌落直径与透明圈直径比值越小，分解纤维素的能力越强，应选择菌落直径与周围透明圈直径比值小的菌落进行纯化，D错误。
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6.(2024·湖北宜荆荆恩四市高三联考)营养缺陷型菌株是突变后某些酶被破坏，导致代谢过程中某些合成反应不能进行的菌株。如图是科研人员利用影印法(用无菌绒布轻盖在已长好菌落的原培养基上，然后不转动任何角度，“复印”至新的培养基上)初检某种氨基酸缺陷型菌株的过程。下列相关说法错误的是
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A.①过程接种方法为稀释涂布平板法，
接种后的培养皿不能立即进行倒置
培养
B.进行②过程的顺序是先将丝绒布“复
印”至完全培养基上，再“复印”
至基本培养基上
C.氨基酸缺陷型菌株应从基本培养基上没有、完全培养基上对应位置有
的菌落中挑选
D.统计菌落种类和数量时要每隔一定时间观察统计一次，直到各类菌落
数目稳定为止
√
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进行②过程培养时，为了防止将完全培养基中特定营养成分带入基本培养基，应先将丝绒布“复印”至基本培养基上，再“复印”至完全培养基上，B错误。
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7.(2024·长春高三调研)研究人员拟从土壤样品中分离出高效降解甲醇的酵母菌并进行大量培养，操作流程如下。下列相关叙述错误的是
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A.为保证无菌操作，接种环使用前必须灼
烧灭菌
B.平板浇注分离法适宜于厌氧型或兼性厌
氧型的微生物的分离和计数
C.挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测
定酵母菌细胞中甲醇的含量
D.为了获得甲醇耐受酵母菌，可通过逐步提高培养基中甲醇的浓度来实现
√
挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定培养液中甲醇的含量，C错误。
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8.(2024·武汉高三检测)空气细菌总数测定主要有自然沉降法和撞击法。自然沉降法是让空气中的细菌自然降至琼脂平板表面，撞击法是将一定量空气以较高的流速喷射撞击到琼脂平板上，空气中的细菌即留滞在琼脂表面。关于自然沉降法和撞击法，下列分析错误的是
A.用于检测空气中细菌总数时都需对不同方位和高度的空气进行采样
B.撞击法对洁净空气中细菌总数的测定比自然沉降法更准确
C.两种方法均可使用无选择性的牛肉膏蛋白胨培养基
D.用两种方法取样后在琼脂平板上形成的菌落均为单菌落
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√
由于上述两种方法都是对空气中细菌总数进行测定，在琼脂平板上形成的菌落有多种，不一定都是单菌落，D错误。
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9.为筛选出可高效抑制番茄枯萎病菌(一类真菌)的土壤芽孢杆菌菌株，科研人员从土壤中采集、分离、筛选芽孢杆菌菌株作为待测菌株，并采用平板对峙培养法观察各待测菌株的抑菌能力。如图为研究过程示意图，下列叙述错误的是
A.过程①常利用移液器取0.1 mL菌液
涂布平板
B.过程②可根据芽孢杆菌菌落的形态、
颜色进行挑选
C.若甲、乙、丙三个平板的平均菌落
数为12个，则10 g土样中芽孢杆菌
约有1.2×109个
D.实验筛选出的菌株仍需进行大田种植试验以检测防治效果
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√
若甲、乙、丙三个平板的平均菌落数为12个，平均菌落数是12个不符合30～300的菌落计数要求，C错误。
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二、非选择题
10.大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12～38 kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。请回答下列问题：
(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以_______为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于______培养基。
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纤维素
选择
在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养；培养基从功能上分类可分为选择培养基和鉴别培养基，故该培养基从功能上分类属于选择培养基。
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(2)配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是________________________
________________________。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是________________________。
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杀死培养基中的所有微生
物(微生物和芽孢、孢子)
不接种培养(或空白培养)
为检测灭菌效果可对培养基进行空白培养，即将未接种的培养基在适宜条件下培养一段时间，若在适宜条件下培养基中无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。
(3)为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37 ℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株_____，理由是________________
____________________________。
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C
接种C菌株后秸秆
失重最多，纤维素降解率最大
菌株 秸秆总重(g) 秸秆残重(g) 秸秆失重(%) 纤维素降解率(%)
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的生成量来表示。由表格可知，在适宜的条件下，C菌株在相同的温度和时间下，秸秆失重最多，纤维素降解率最大，说明该菌株的纤维素分解菌产生的纤维素酶活力最大。
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菌株 秸秆总重(g) 秸秆残重(g) 秸秆失重(%) 纤维素降解率(%)
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
11.(2024·南京高三调研)生物兴趣小组试图探究牛和山羊的瘤胃中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：
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KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10 g
尿素 1 g
琼脂 15 g
溶解后蒸馏水定容到1 000 mL
(1)本实验所使用的培养基按功能来分应为_____
培养基，原理是___________________________
_______________________________。
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只有能合成脲酶的细菌才能分解尿素，才能在该培养基上生长
(2)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_____________________
______________________________________。
为细菌生长提供无机盐、作为缓冲剂维持细胞生长过程中pH的稳定
选择
(3)实验是否需要振荡培养来提高溶氧量：_____
(填“是”或“否”)，原因是________________
______________________________。转为固体培养时，常采用__________________________法接种，获得单菌落后继续筛选。
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否
瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡
平板划线法或稀释涂布平板
(4)若在稀释倍数为105的三个培养基中，菌落数分别是156、174、183，则每克内容物中尿素分解菌的数目为__________个。
1.71×108
(5)为证明分离得到的细菌是否可以分解尿素，可在培养基中加入________指示剂，看指示剂是否________。
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酚红
变红
(6)为进一步确定取自瘤胃中液体的适当稀释倍数，将接种的培养皿放置在37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察并统计具有红色环带的菌落数，结果见表，其中合理的稀释倍数为__________。
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106或105
稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 >500 367 248 36 18
12.菌落总数可作为判定食品被污染程度的标志，也可以用于观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对送检样品进行卫生学评估提供证据。下图是某样品培养简化流程图，请分析回答下列问题：
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(1)该营养琼脂培养基配制过程中，其基本步骤包括按照培养基配方准确计算、称量、溶化、调节pH、_______________________法灭菌等。然后将培养基放入47 ℃水浴锅保温，选择此温度的理由是______________
_____________________________________________。
高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)
保证培养基处
于溶化状态(在凝固之前接种且不致将培养物烫死)
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配制培养基时应按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的pH，并进行高压蒸汽灭菌；然后将培养基放入47 ℃水浴锅保温，用手触摸不烫手以便于操作，并能保证培养基处于溶化状态，且在凝固之前接种不致将培养物烫死。
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(2)实验过程中须将样品剪碎并使用均质器10 000 r·min－1处理1 min，其目的是_______________________________。从水浴锅取出营养琼脂培养基倒平板适量，稍冷却后移液0.2 mL样品于培养皿进行涂布，涂布时可______________，使涂布更均匀。
尽量使样品中的微生物细胞分散
转动培养皿
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实验过程中要将样品剪碎并使用均质器10 000 r·min－1处理1 min，尽量使样品中的微生物细胞分散；为了使涂布更均匀，涂布时可转动培养皿。
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(3)本实验用菌落计数的原理是基于________________________，运用这种方法统计的结果往往较实际值偏______。具体培养结果如下表。选取菌落数30～300的培养皿作为菌落总数的测定标准。当只有一个稀释浓度的平均菌落数符合此范围，以该培养皿菌落数×稀释倍数报告。当有两个浓度菌落值在30～300之间，报告结果由二者菌落数比值决定，若比值不大于2，则取平均数，且菌落数大于100取两位有效数字，两位之后的数值四舍五入；若比值大于2，则报告稀释度较低(稀释次数越多，稀释度越高)的培养皿菌落数。请填写例次3中“？”处的菌落总数为________。
例次 不同稀释度平均菌落数 两稀释度 菌落数之比 菌落总数
/[CFU/ mL(g)]
10－1 10－2 10－3
1 1 365 164 20 — 16 400
2 2 760 295 46 1.6 38 000
3 2 890 271 60 2.2 ？
一个菌落代表一个活菌
小
27 100
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根据题意可知，例次3应选取稀释度为10－2的菌落数报告，则例次3菌落总数为271×100＝27 100。
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(4)利用鲜奶进行工业生产酸奶时，不能使用________污染的鲜奶为原料，否则会使乳酸菌生长受到限制；利用_______法可以除去鲜奶中的白细胞、杂菌和其他肉眼可见的异物，取其上清液用于发酵制酸奶。
抗生素
离心
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抗生素污染会使乳酸菌生长受到限制，因此不能使用抗生素污染的鲜奶为原料生产酸奶，原料乳中可能含有细胞类物质(如上皮细胞的白细胞等)，其中一些是牛乳中固有的，也有一些是挤奶过程中牛乳受污染而带进牛奶的，为了保证产品获得良好的最终质量，酸乳制作中第一步就是要除去这些污染物质，常利用特别设计的离心机进行离心除去牛乳中的白细胞和其他肉眼可见的异物。
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(5)密封良好的泡菜坛内有时会长一层白膜，这些白膜是________(填“乳酸菌”或“酵母菌”)繁殖产生的。在泡菜腌制过程中坛、蔬菜等均未进行严格灭菌，而在发酵过程中一般不会出现其他杂菌大量繁殖，其原因是_____(填序号)。
①发酵的原料中缺乏杂菌生长需要的各种营养物质
②发酵过程的温度不适合杂菌的生长
③乳酸菌产生较多乳酸，许多好氧菌被杀死
④在自然界中乳酸菌占优势
酵母菌
③
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泡菜发酵利用的菌种是乳酸菌，在发酵过程中，乳酸菌产生的乳酸及无氧环境不利于其他杂菌的生长，所以发酵过程中一般不用严格灭菌，泡菜坛内表面会长出一层白膜，这些白膜是酵母菌繁殖产生的。
返回第57课时　微生物的培养技术与应用
课标要求 1.通过配制培养基、灭菌、接种和培养等实验操作获得纯化的酵母菌菌落。2.分离土壤中分解尿素的细菌，并进行计数。
考情分析 1.微生物的基本培养技术 2023·全国乙·T37 2022·天津·T3　2021·天 津·T1
2.微生物的选择培养和计数 2023·山东·T15　2023·广东·T10　2023·北京·T16　2022·全国甲·T37 2022·全国乙·T37　2022·广东·T21　2021·江苏·T18
考点一　微生物的基本培养技术
1．培养基的配制
(1)培养基的概念、用途和类型
①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
②用途：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
③培养基的种类(按物理性质分)
培养基种类 培养基特点 作用
固体培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定
液体培养基 不加凝固剂 常用于工业生产、微生物的扩大培养
(2)培养基的配方
①主要营养物质：水、碳源、氮源、无机盐。
②其他条件：pH、特殊营养物质和氧气。如表：
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物
特殊需求 添加维生素 一般pH调至酸性 一般pH调至中性或弱碱性 无氧
2.无菌技术
(1)目的：获得纯净的微生物培养物。
(2)关键：防止杂菌污染。
(3)消毒与灭菌的比较
项目 消毒 灭菌
作用强度 较为温和的理化因素 强烈的理化因素
作用程度 杀死物体表面或内部一部分微生物 杀死物体内外所有的微生物
芽孢和孢子 一般不能杀灭 能杀灭
适用对象 实验操作的空间、操作者的衣着和双手 微生物培养的器皿、接种用具和培养基等
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法等 湿热灭菌法、干热灭菌法、灼烧灭菌法等
(4)注意事项
①实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
②为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
3．微生物的纯培养概念辨析
4．纯培养的过程(以酵母菌为例)：包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
(1)制备培养基
倒平板注意事项：a.温度：50 ℃左右；b.操作：在酒精灯火焰附近；c.冷凝后平板倒置。
提醒　平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快挥发。
(2)接种和分离酵母菌
①平板划线法的原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
②平板划线法的操作步骤
(3)培养酵母菌
将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养24～48 h。
判断正误
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质(　√　)
(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　×　)
提示　倒平板时，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将锥形瓶中的培养基(10～20 mL)倒入培养皿，立即盖上培养皿的皿盖，不能打开皿盖。
(3)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(　×　)
提示　接种环灼烧灭菌后，应冷却后再挑取菌落，以免高温杀死菌种。
(4)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和灭菌(　×　)
提示　对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
发酵生产啤酒的过程中，杂菌产生的微量副产物是啤酒“上头”的原因之一，可采用平板划线法对酵母菌进行纯化。如图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题：
(1)用图中字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤：d→b→f→a→e→c→h→g。
(2)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
提示　需要；划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。
(3)在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
提示　划线后，线条末端菌种的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(4)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？
提示　培养未接种的培养基的作用是对照，未接种的培养基经过培养后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。
考向一　微生物的基本培养技术
1．(2022·湖北，4)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　　)
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
答案　D
解析　动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，但微生物的培养不能加入抗生素，因为抗生素会杀死某些微生物，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，防止杂菌污染，C错误。
2．(2020·江苏，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
答案　B
解析　温度降低后，培养基易凝固，因此倒平板后要及时轻轻晃动，以保持均一性，A错误；由题图可知，随着划线次数增多，细菌密度逐渐减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C错误；刚果红能与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D错误。
考点二　微生物的选择培养和计数
1．区分选择培养基与鉴别培养基
种类 特点 用途 举例
选择培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长 从众多微生物中分离所需的微生物 以尿素为唯一氮源的培养基分离得到尿素分解菌
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌
提醒　常见选择培养基举例：(1)缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。(2)含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。(3)无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2．微生物的选择培养和数量测定
(1)稀释涂布平板法步骤
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
操作步骤：
②涂布平板操作步骤
(2)微生物的数量测定方法
①显微镜直接计数法
提醒　显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，但是通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
②间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)
a．原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
b．计数原则：为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
c．误差分析：用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低(填“高”或“低”)，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
(1)实验原理
(2)实验流程
(3)实验结果分析与评价
判断正误
(1)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数(　×　)
提示　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落，故稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
(2)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计(　×　)
提示　统计菌落数目时为保证结果准确，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
(3)利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数(　×　)
提示　利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离，但平板划线法不能用于微生物的计数。
(4)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量(　×　)
提示　显微镜直接计数法不能区分细菌的死活，因此统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
在发酵生产啤酒过程中，要随时检测培养液中的酵母菌数量、产物浓度等，以了解发酵进程。甲、乙、丙三位同学用稀释涂布平板法测定同一培养液的酵母菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下三种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
提示　不可靠；为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
提示　不合理；微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
(3)在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
提示　作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
(4)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示　尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落特征。
(5)丙同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)，那么稀释倍数为106的试管中细菌的浓度是2.34×103个/mL。每克样品中的细菌数是2.34×109个。
归纳总结
考向二　目标微生物的筛选与鉴定
3.(2023·广东，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　)
A．a点时取样、尿素氮源培养基
B．b点时取样、角蛋白氮源培养基
C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D．c点时取样、角蛋白氮源培养基
答案　D
解析　研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应在c点时取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D符合题意。
4．(2022·江苏，3)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是(　　)
A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
答案　D
解析　农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A正确；为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，能合成脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。
考向三　微生物的分离与计数
5．(2024·湖北高三调研)研究者从温泉中筛选出能高效产生耐高温淀粉酶的嗜热细菌的过程如图1所示。将得到的嗜热细菌悬液转接到特定固体培养基上培养，得到若干菌落后用碘液作显色处理，结果如图2所示。下列说法错误的是(　　)
A．过程①②一般都取1 mL菌液转移
B．试管甲、乙都通过无菌水稀释
C．图2中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种
D．过程①②属于稀释涂布平板法，能对分离得到的微生物进行计数
答案　A
解析　过程①为稀释过程，一般都取1 mL菌液转移，过程②为涂布平板过程，一般取0.1 mL菌液进行涂布，A错误；图2中周围不显蓝色的菌落产生的淀粉酶可以在高温下分解淀粉，所以周围不显蓝色的菌落含有所需菌种，C正确。
6．(2020·江苏，31)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是________(填编号)。
编号 ① ② ③ ④
物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器
灭菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧
(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经__________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌________个。
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行____________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以______为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径______的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株________进行后续相关研究，理由是________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
答案　(1)④　(2)等比稀释　4.6×105(或460 000)
(3)诱变　脂肪　较大　(4)B　该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
解析　(2)利用稀释涂布平板法统计活菌数目时，需要将制备的菌悬液进行等比稀释，以获得细胞密度不同的菌悬液，一般来说，菌落数为30～300的平板最适于计数。0.1 mL菌悬液中含有46个酵母菌落，则1 mL菌悬液中含有460个酵母菌落；1.0 g土壤样品首先稀释100倍，然后稀释10倍，共稀释了1 000倍，因此样本中每克土壤约含酵母菌460×1 000＝4.6×105(个)。(3)采用射线辐照引起酵母菌基因突变，此种方法属于诱变育种。检查诱变酵母菌产脂肪酶的能力，需要把酵母菌接种到以脂肪为唯一碳源的培养基上，按照产生菌落直径大小进行初步筛选，直径大的说明产酶能力强，利用的脂肪(碳源)多，直径小的说明产酶能力弱，利用的脂肪(碳源)少。(4)通过分析题图可知，相同时间内，菌株B细胞密度大，说明该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；相同时间内，菌株B利用的脂肪多，脂肪剩余量少，说明该菌株降解脂肪的能力强，净化效果好。
1．(选择性必修3 P10)培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源等。
2．(选择性必修3 P11)无菌技术的选择：对于一些不耐高温的液体，如牛奶，可使用巴氏消毒法；用氯气消毒水源；培养基一般采用湿热灭菌法进行灭菌；培养皿可以采用干热灭菌法灭菌；接种环可以采用灼烧灭菌法灭菌。
3．(选择性必修3 P13)平板划线操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
4．(选择性必修3 P16)选择培养基是指在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
5．(选择性必修3 P19)检测培养物中是否有杂菌污染的方法是同时培养灭菌后的未接种的培养基，观察是否有菌落产生。判断选择培养基是否起到筛选作用的方法是配制牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，观察选择培养基上的菌落数是否远少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目。
6．(2023·新课标，35节选)从豆科植物的根瘤中分离根瘤菌进行培养，可以获得纯培养物，此实验中的纯培养物是由根瘤菌繁殖形成的单菌落。
7．(2021·广东，21节选)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是盐浓度为60_g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制(答出两点即可)。
8．(2023·全国乙，37节选)在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是菌T能够分泌纤维素酶。
9．(2022·河北，23节选)枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用摇床震荡(填“静置”或“摇床震荡”)培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用稀释涂布平板法(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内。
10．(2022·全国乙，37节选)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C，测定不同浓度制糖废液中S产量，寻找S产量最大的碳源浓度，确定最适碳源浓度。
课时精练
一、选择题
1．(2024·重庆高三联考)熔喷布的主要成分是聚丙烯，会对环境造成污染。某科研小组从土壤中分离到一种能分解聚丙烯的细菌。下列说法正确的是(　　)
A．配制固体培养基时，需要在无菌的环境中进行
B．制备培养基时需要先将培养基的pH调节至中性或弱碱性
C．从土壤中分离能分解聚丙烯的细菌，可采用平板划线法进行分离与计数
D．纯化培养时，在培养皿皿盖做标记后倒置在恒温培养箱中静置培养
答案　B
解析　配制固体培养基时，不需要在无菌的环境中进行，因为培养基配制好之后会进行灭菌，A错误；平板划线法只能对微生物进行分离，不能计数，C错误；纯化培养时，在培养皿皿底做标记后倒置在恒温培养箱中静置培养，这样方便观察，D错误。
2．(2023·淮安高三模拟)如图为实验室中酵母菌纯培养过程的部分操作步骤，下列说法正确的是(　　)
A．微生物的纯培养物就是指不含代谢废物的微生物培养物
B．步骤①中，用手触摸估计培养基冷却至室温后开始倒平板
C．步骤①使用的培养基制备过程是先调pH再灭菌
D．③到④过程中，每次划线后都需要灼烧接种环并蘸取菌液
答案　C
解析　由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，A错误；步骤①中，用手触摸估计培养基冷却至50 ℃左右时，开始倒平板，B错误；③到④过程中，每次划线后对接种环进行灼烧处理，是为了杀死接种环上残留的菌种，使划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，不需要重新蘸取菌液，D错误。
3．(2021·山东，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是(　　)
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
答案　B
解析　乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误。
4．(2023·山东，15)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　)
A．不含氮源的平板不能用于微生物培养
B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
答案　D
解析　不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须先浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素进行生长繁殖，D正确。
5．(2024·咸阳高三调研)为加速我国北方冬春季秸秆原位还田的腐化过程，研究人员以冻牛粪为材料筛选出耐低温(10 ℃)的纤维素降解菌。下列相关叙述正确的是(　　)
A．选用冻牛粪为材料与其富含纤维素及含耐低温微生物有关
B．初筛菌种前，要利用固体培养基在37 ℃条件下扩大培养目标菌种
C．用于筛选的培养基是加入刚果红染料的牛肉膏蛋白胨培养基
D．应选择菌落直径与周围透明圈直径比值大的菌落进行纯化
答案　A
解析　筛选耐低温的纤维素降解菌需要到其所生活的环境中寻找，冻牛粪中富含纤维素和耐低温微生物，所以选用冻牛粪为材料可筛选出耐低温的纤维素降解菌，A正确；初筛菌种前，要利用液体培养基在10 ℃条件下扩大培养目标菌种，B错误；用于筛选的培养基是以纤维素为唯一碳源的固体培养基，加入刚果红染料起鉴别作用，C错误；菌落直径与透明圈直径比值越小，分解纤维素的能力越强，应选择菌落直径与周围透明圈直径比值小的菌落进行纯化，D错误。
6．(2024·湖北宜荆荆恩四市高三联考)营养缺陷型菌株是突变后某些酶被破坏，导致代谢过程中某些合成反应不能进行的菌株。如图是科研人员利用影印法(用无菌绒布轻盖在已长好菌落的原培养基上，然后不转动任何角度，“复印”至新的培养基上)初检某种氨基酸缺陷型菌株的过程。下列相关说法错误的是(　　)
A．①过程接种方法为稀释涂布平板法，接种后的培养皿不能立即进行倒置培养
B．进行②过程的顺序是先将丝绒布“复印”至完全培养基上，再“复印”至基本培养基上
C．氨基酸缺陷型菌株应从基本培养基上没有、完全培养基上对应位置有的菌落中挑选
D．统计菌落种类和数量时要每隔一定时间观察统计一次，直到各类菌落数目稳定为止
答案　B
解析　进行②过程培养时，为了防止将完全培养基中特定营养成分带入基本培养基，应先将丝绒布“复印”至基本培养基上，再“复印”至完全培养基上，B错误。
7．(2024·长春高三调研)研究人员拟从土壤样品中分离出高效降解甲醇的酵母菌并进行大量培养，操作流程如下。下列相关叙述错误的是(　　)
A．为保证无菌操作，接种环使用前必须灼烧灭菌
B．平板浇注分离法适宜于厌氧型或兼性厌氧型的微生物的分离和计数
C．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母菌细胞中甲醇的含量
D．为了获得甲醇耐受酵母菌，可通过逐步提高培养基中甲醇的浓度来实现
答案　C
解析　挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定培养液中甲醇的含量，C错误。
8．(2024·武汉高三检测)空气细菌总数测定主要有自然沉降法和撞击法。自然沉降法是让空气中的细菌自然降至琼脂平板表面，撞击法是将一定量空气以较高的流速喷射撞击到琼脂平板上，空气中的细菌即留滞在琼脂表面。关于自然沉降法和撞击法，下列分析错误的是(　　)
A．用于检测空气中细菌总数时都需对不同方位和高度的空气进行采样
B．撞击法对洁净空气中细菌总数的测定比自然沉降法更准确
C．两种方法均可使用无选择性的牛肉膏蛋白胨培养基
D．用两种方法取样后在琼脂平板上形成的菌落均为单菌落
答案　D
解析　由于上述两种方法都是对空气中细菌总数进行测定，在琼脂平板上形成的菌落有多种，不一定都是单菌落，D错误。
9．为筛选出可高效抑制番茄枯萎病菌(一类真菌)的土壤芽孢杆菌菌株，科研人员从土壤中采集、分离、筛选芽孢杆菌菌株作为待测菌株，并采用平板对峙培养法观察各待测菌株的抑菌能力。如图为研究过程示意图，下列叙述错误的是(　　)
A．过程①常利用移液器取0.1 mL菌液涂布平板
B．过程②可根据芽孢杆菌菌落的形态、颜色进行挑选
C．若甲、乙、丙三个平板的平均菌落数为12个，则10 g土样中芽孢杆菌约有1.2×109个
D．实验筛选出的菌株仍需进行大田种植试验以检测防治效果
答案　C
解析　若甲、乙、丙三个平板的平均菌落数为12个，平均菌落数是12个不符合30～300的菌落计数要求，C错误。
二、非选择题
10．大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12～38 kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。请回答下列问题：
(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以__________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于________培养基。
(2)配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是_________________________________________
_______________________________________________________________________________。
检测固体培养基灭菌效果的常用方法是____________________________________________。
(3)为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37 ℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株________，理由是_______________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
菌株 秸秆总重(g) 秸秆残重(g) 秸秆失重(%) 纤维素降解率(%)
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
答案　(1)纤维素　选择　(2)杀死培养基中的所有微生物(微生物和芽孢、孢子)　不接种培养(或空白培养)　(3)C　接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大
解析　(1)在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养；培养基从功能上分类可分为选择培养基和鉴别培养基，故该培养基从功能上分类属于选择培养基。(2)为检测灭菌效果可对培养基进行空白培养，即将未接种的培养基在适宜条件下培养一段时间，若在适宜条件下培养基中无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。(3)测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的生成量来表示。由表格可知，在适宜的条件下，C菌株在相同的温度和时间下，秸秆失重最多，纤维素降解率最大，说明该菌株的纤维素分解菌产生的纤维素酶活力最大。
11．(2024·南京高三调研)生物兴趣小组试图探究牛和山羊的瘤胃中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10 g
尿素 1 g
琼脂 15 g
溶解后蒸馏水定容到1 000 mL
(1)本实验所使用的培养基按功能来分应为______培养基，原理是____________________。
(2)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_______________
____________________________________________________________________________。
(3)实验是否需要振荡培养来提高溶氧量：______(填“是”或“否”)，原因是____________。转为固体培养时，常采用__________________________法接种，获得单菌落后继续筛选。
(4)若在稀释倍数为105的三个培养基中，菌落数分别是156、174、183，则每克内容物中尿素分解菌的数目为__________个。
(5)为证明分离得到的细菌是否可以分解尿素，可在培养基中加入________指示剂，看指示剂是否______________。
(6)为进一步确定取自瘤胃中液体的适当稀释倍数，将接种的培养皿放置在37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察并统计具有红色环带的菌落数，结果见表，其中合理的稀释倍数为__________。
稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 >500 367 248 36 18
答案　(1)选择　只有能合成脲酶的细菌才能分解尿素，才能在该培养基上生长　(2)为细菌生长提供无机盐、作为缓冲剂维持细胞生长过程中pH的稳定　(3)否　瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡　平板划线法或稀释涂布平板　(4)1.71×108　(5)酚红　变红　(6)106或105
12．菌落总数可作为判定食品被污染程度的标志，也可以用于观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对送检样品进行卫生学评估提供证据。下图是某样品培养简化流程图，请分析回答下列问题：
(1)该营养琼脂培养基配制过程中，其基本步骤包括按照培养基配方准确计算、称量、溶化、调节pH、____________________法灭菌等。然后将培养基放入47 ℃水浴锅保温，选择此温度的理由是____________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
(2)实验过程中须将样品剪碎并使用均质器10 000 r·min－1处理1 min，其目的是__________________________________。从水浴锅取出营养琼脂培养基倒平板适量，稍冷却后移液0.2 mL样品于培养皿进行涂布，涂布时可______________，使涂布更均匀。
(3)本实验用菌落计数的原理是基于__________________________________，运用这种方法统计的结果往往较实际值偏________。具体培养结果如下表。选取菌落数30～300的培养皿作为菌落总数的测定标准。当只有一个稀释浓度的平均菌落数符合此范围，以该培养皿菌落数×稀释倍数报告。当有两个浓度菌落值在30～300之间，报告结果由二者菌落数比值决定，若比值不大于2，则取平均数，且菌落数大于100取两位有效数字，两位之后的数值四舍五入；若比值大于2，则报告稀释度较低(稀释次数越多，稀释度越高)的培养皿菌落数。请填写例次3中“？”处的菌落总数为________。
例次 不同稀释度平均菌落数 两稀释度菌落数之比 菌落总数/[CFU/ mL(g)]
10－1 10－2 10－3
1 1 365 164 20 — 16 400
2 2 760 295 46 1.6 38 000
3 2 890 271 60 2.2 ？
(4)利用鲜奶进行工业生产酸奶时，不能使用______污染的鲜奶为原料，否则会使乳酸菌生长受到限制；利用________法可以除去鲜奶中的白细胞、杂菌和其他肉眼可见的异物，取其上清液用于发酵制酸奶。
(5)密封良好的泡菜坛内有时会长一层白膜，这些白膜是____________(填“乳酸菌”或“酵母菌”)繁殖产生的。在泡菜腌制过程中坛、蔬菜等均未进行严格灭菌，而在发酵过程中一般不会出现其他杂菌大量繁殖，其原因是________(填序号)。
①发酵的原料中缺乏杂菌生长需要的各种营养物质
②发酵过程的温度不适合杂菌的生长
③乳酸菌产生较多乳酸，许多好氧菌被杀死
④在自然界中乳酸菌占优势
答案　(1)高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)　保证培养基处于溶化状态(在凝固之前接种且不致将培养物烫死)　(2)尽量使样品中的微生物细胞分散　转动培养皿　(3)一个菌落代表一个活菌　小　27 100　(4)抗生素　离心　(5)酵母菌　③
解析　(1)配制培养基时应按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的pH，并进行高压蒸汽灭菌；然后将培养基放入47 ℃水浴锅保温，用手触摸不烫手以便于操作，并能保证培养基处于溶化状态，且在凝固之前接种不致将培养物烫死。(2)实验过程中要将样品剪碎并使用均质器10 000 r·min－1处理1 min，尽量使样品中的微生物细胞分散；为了使涂布更均匀，涂布时可转动培养皿。(3)根据题意可知，例次3应选取稀释度为10－2的菌落数报告，则例次3菌落总数为271×100＝27 100。(4)抗生素污染会使乳酸菌生长受到限制，因此不能使用抗生素污染的鲜奶为原料生产酸奶，原料乳中可能含有细胞类物质(如上皮细胞的白细胞等)，其中一些是牛乳中固有的，也有一些是挤奶过程中牛乳受污染而带进牛奶的，为了保证产品获得良好的最终质量，酸乳制作中第一步就是要除去这些污染物质，常利用特别设计的离心机进行离心除去牛乳中的白细胞和其他肉眼可见的异物。(5)泡菜发酵利用的菌种是乳酸菌，在发酵过程中，乳酸菌产生的乳酸及无氧环境不利于其他杂菌的生长，所以发酵过程中一般不用严格灭菌，泡菜坛内表面会长出一层白膜，这些白膜是酵母菌繁殖产生的。

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