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(共117张PPT)
第61课时
基因工程的基本工具和基本操作程序
1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展起来的。
2.阐明重组DNA技术的三种基本工具。
3.阐明基因工程的基本操作程序。
课标要求
考情分析
1.基因工程的基本工具 2023·新课标·T6　2021·全国乙·T38　2021·湖北·T7
2.基因工程的基本操作程序 2023·全国乙·T38　2023·全国甲·T38　2023·湖北·T4　
2023·广东·T20　2021·广东·T22
内容索引
考点一　　基因工程的基本工具
考点二　　基因工程的基本操作程序
课时精练
考点一
基因工程的基本工具
1.基因工程的概念
DNA分子
转基因
遗传特性
生物类型
基因重组
2.基因工程的诞生和发展
(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间 。
(2)DNA双螺旋结构的提出和 的证明。
(3)中心法则的确立。
(4) 的破译。
(5)基因转移载体的发现。 的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
转移
半保留复制
遗传密码
限制酶、DNA连接酶和逆转录酶
(6) 体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9) 技术的发明。
(10) 技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
DNA
PCR
基因组编辑
3.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(简称
“限制酶”)
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
磷酸二酯键
提醒　①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。
③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
(3)载体
环状双链DNA分子
噬菌体
有一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
(1)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的(　　)
提示　基因工程是人工操作导致的基因重组，变异是定向的。
×
(2)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA(　　)
提示　DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
×
(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶
(　　)
提示　限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。
×
(4)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因(　　)
提示　质粒上的抗生素抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
×
将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：
(1)请用图示法写出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的过程。
提示　限制酶EcoRⅠ：
限制酶NheⅠ：
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示　用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的
基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形
成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ
切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
限制酶的选择
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其
中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的
两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
考向一　辨析基因工程的基本工具
1.(2021·湖北，7)限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割 双
链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
√
1
2
据图可知，EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于
DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点
出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4
＝1/4 096，即4 096个碱基对可能出现一个限制酶EcoRⅠ的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4 096，与4 000最接近，C符合题意。
1
2
2.(2024·连云港高三调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是
1
2
项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况
① 能生长 不能生长
② 能生长 能生长
③ 不能生长 能生长
A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点
B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b
C.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个
D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶
1
2
项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况
① 能生长 不能生长
② 能生长 能生长
③ 不能生长 能生长
√
质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；
①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；
将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。
1
2
返回
返回
与DNA有关的几种酶的比较
考点二
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用 和序列比对工具进行筛选。
性状
表达产物
结构和功能清晰
序列数据库
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR 和扩增目的基因
a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。
b.PCR反应的条件：一定的 、DNA模板、2种 、4种____________、 DNA聚合酶，以及能自动调控 的仪器。
获取
DNA半保留复制
组分
大量复制
缓冲溶液
引物
脱氧核苷酸
耐高温的
温度
c.PCR扩增的过程
90
单链
50
引物
72
耐高温的DNA聚合酶
d.PCR产物的鉴定：常采用 来鉴定。
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术和DNA
复制的比较
③通过构建 来获取目的基因。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
基因文库
在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代
(2)基因表达载体的组成及作用
启动子
标记基因
(3)构建过程
提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、________ ______ 显微注射法 ______处理法
受体细胞 ________________ _________ 原核细胞
花粉管通
道法
Ca2＋
体细胞或受精卵
受精卵
生物种类 植物 动物 微生物
转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
辨析　(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
4.目的基因的检测与鉴定
(1)目的基因一定是编码蛋白质的基因(　　)
提示　目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
×
(2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋(　　)
√
(3)基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束(　　)
提示　启动子和终止子决定着转录的开始与结束。
×
(4)Ti质粒上的T－DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起(　　)
(5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(　　)
提示　为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时能以受精卵为受体，也能以体细胞为受体。
√
×
(6)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术(　　)
提示　检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR等技术。
×
1.Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。回答下列问题：
(1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？
提示　引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。
(2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗？
提示　不需要，只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。
(3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么？
提示　引物是依据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt毒蛋白基因在PCR中经过n轮循环，理论上得到多少个DNA分子？含引物的DNA分子多少个？含其中一种引物的DNA分子多少个？同时含两种引物的DNA分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？
提示　经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子 (2n－2n)个。
(5)PCR扩增Bt基因的过程中需要解旋酶吗？并说明理由。所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
提示　不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下即可完成解旋。由于PCR过程温度较高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。
2.据图分析抗虫棉的培育过程。
(1)该过程中的目的基因是________，载体是________。
(2)基因工程中，往往使用两种限制酶切割目的基因，这样做的原因是什么？
提示　为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连接。
Bt基因
Ti质粒
(3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？
提示　目的基因应插入启动子与终止
子之间。
(4)该实例中，导入目的基因的方法是 。为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？
提示　由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
农杆菌转化法
(5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上？为什么？
提示　一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。
(6)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪些？
提示　抗原—抗体杂交、用棉叶饲喂棉铃虫。
考向二　辨析基因工程的基本操作程序
3.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一
定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒
构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
3
4
√
若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；
若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
3
4
DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，
若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
3
4
4.(2024·江苏扬州中学高三模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是
A.目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA
B.用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C.Ti质粒是一种环状DNA分子，没有双螺旋结构
D.可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上
3
4
√
在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T－DNA片段上，有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上，A错误；
农杆菌侵染植物细胞不需要用Ca2＋处理，B错误；
Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的DNA，具有双螺旋结构，C错误。
3
4
1. (选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的 ，创造出更符合人们需要的新的______________
________。
2.(选择性必修3 P71)限制酶能够识别 ，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
3.(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于 。
转基因
遗传特性
物产品
生物类型和生
双链DNA分子的特定核苷酸序列
重组DNA分子的筛选
4.(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供
、 、4种 和耐高温的 。
5.(选择性必修3 P77)真核细胞和细菌的 都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段___________
_____________________________________，引物的作用是___________
______________________________________。
DNA模板
2种引物
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
DNA聚合酶
能与DNA母
链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
使DNA聚合
酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
6.(选择性必修3 P80)基因表达载体的构建的目的：使目的基因__________
_____________________________，同时，使目的基因能够____________
______。基因表达载体是载体的一种，除目的基因、___________外，还必须含有启动子、终止子等。启动子是______________识别和结合的部位，有了它才能驱动基因____________，最终表达出人类需要的_______。
7.(选择性必修3 P81)转化：________________________________________
________________________。
在受体细胞
中稳定存在，并且遗传给下一代
表达和发挥
作用
标记基因
RNA聚合酶
转录出mRNA
蛋白质
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
8.(选择性必修3 P81～82)将目的基因导入植物细胞的方法是_____________、______________；导入动物细胞的方法是____________；导入微生物细胞的方法是_______处理法。
农杆菌转化法
花粉管通道法
显微注射法
Ca2＋
9.(选择性必修3 P82)目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过_____等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取_______，用相应的____进行_______________，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过__________________________来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
PCR
蛋白质
抗体
抗原—抗体杂交
采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
10.如图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点为：Hind Ⅲ(A↓AGCTT)、Pvit Ⅱ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcoRⅠ(G↓AATTC)、
PstⅠ(CTGCA↓G)、BamHⅠ(G↓GATCC)。为使phb2基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的
phb2基因两端分别引入 和 两种
不同限制酶的识别序列。将经过这两种酶酶切
的phb2基因和载体进行连接时，可选用_______
________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
Pvit Ⅱ
EcoRⅠ
T4 DNA
连接酶
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课时精练
一、选择题
1.(2024·泉州高三质检)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、Bgl Ⅱ(－A↓GATCT－)、MboⅠ(－↓GATC－)这样，识别序列不同，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是
1
2
3
4
5
6
7
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9
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11
12
13
1
2
3
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选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析
A BclⅠ和BglⅡ BclⅠ和BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B BclⅠ和BglⅡ MboⅠ 切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化
C MboⅠ BclⅠ和BglⅡ 形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开，但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开
D MboⅠ MboⅠ 切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化
√
13
切割质粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ时，切割后产生的黏性末端相同，形成重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，A正确；
用BclⅠ和BglⅡ切割质粒，切割后产生的黏性末端相同，切割后的质粒可能自我环化，B错误；
1
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切割质粒用MboⅠ，切割目的基因用BclⅠ和Bgl Ⅱ，产生相同的黏性末端，形成的重组质粒中有MboⅠ的切割位点，但不一定有BclⅠ和Bgl Ⅱ的切割位点，因此形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开，但可能无法被BclⅠ和Bgl Ⅱ再次切开，C正确；
切割质粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，切割后的质粒和目的基因均可以自我环化，D正确。
1
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2.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
1
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下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
1
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12
√
13
酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；
质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；
质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；
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若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。
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13
3.(2023·重庆，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是
A.其中一个引物序列为
5′－TGCGCAGT－3′
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ
和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进
行酶切，至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
√
1
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根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B错误；
用步骤①的限制酶NheⅠ和限制酶CfoⅠ对载体(环状DNA)进行酶切，切割之后至少获得了2个片段，C正确；
由于引物只能引导子链从5′端到3′端延伸，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′，A正确；
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可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，D正确。
E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，图中酶切后形成的是黏性末端，酶切片段和载体连接时，
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4.(2024·镇江高三二模)转基因植物中标记基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分离剔除法和重组剔除法。分离剔除法是在转基因时将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，通过共转化得到转基因植物后让其自交得到不含标记基因的转基因个体；重组剔除法利用Cre/LoxP重组酶系统，Cre酶能有效剔除重组载体中含有标记基因的序列，只留下一个LoxP位点，具体原理如图。下列说法不正确的是
1
2
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13
A.利用分离剔除法时，目的基
因和标记基因都应插到Ti质
粒的T－DNA序列内部
B.分离剔除时目的基因和标记
基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上均可成功
C.上述重组载体中启动子1在农杆菌中可发挥作用，而在植物细胞中不能
发挥作用
D.经重组剔除后的标记基因，因没有启动子而无法启动基因的转录
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√
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序列内部，进而成功整合到受体细胞染色体DNA上，A正确；
分离剔除时目的基因和标记基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上最终均可获得不含标记基因的转基因个体，即均可成功，B正确；
Ti质粒的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上，所以利用分离剔除法时，目的基因和标记基因都应插到Ti质粒的T－DNA
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重组剔除时，Cre酶基因应该在植物细胞中表达，故上述重组载体中启动子1在农杆菌中不能发挥作用，而在植物细胞中能发挥作用，C错误；
由图可知，经重组剔除后的标记基因没有启动子，无法启动基因的转录，D正确。
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5.如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是
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A.过程①中除草剂抗性基因插
入T－DNA中，导致T－DNA
片段失活
B.过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化
C.过程②用Ca2＋处理，使农杆菌细胞壁通透性改变，使其处于能吸收周围环
境中DNA分子的生理状态
D.过程③应在培养基中加入除草剂和物质K
√
13
过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，不会导致T－DNA片段失活，A错误；
过程①使用两种限制酶，且这两种限制酶切割产生的黏性末端不同，才可以防止酶切产物自身环化，B错误；
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过程③应在培养基中加入除草剂和物质K，除草剂是用来检测目的基因是否正确表达，物质K是用来检测目的基因有没有导入植物细胞中，加入除草剂可保留转化的愈伤组织和附着农杆菌但未转化的愈伤组织，其中变蓝的为转化的愈伤组织，D正确。
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6.(2024·西安高三一模)我国科学家利用XbaⅠ和SacⅠ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678 bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图表示相关培育过程(质粒的其他部位和目的基因内部均无XbaⅠ、SacⅠ、Hind Ⅲ的识别位点)，下列说法不正确的是
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A.一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次，共产生8个等长DNA分子
B.农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法
C.植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株
D.使用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后能得到1 500 bp左右的片段
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√
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一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次共产生等长的DNA分子数24－2×4＝8(个)，A正确；
因为插入植物细胞染色体上的是质粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，导入成功的植物细胞对卡那霉素无抗性，C错误；
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根据切割目的基因的限制酶在质粒上的切割位点，可知由于重组质粒上移除1 900 bp而补充了含678 bp的目的基因，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后，可得到822＋678＝1 500(bp)左右的新片段，D正确。
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7.自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
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下列相关叙述错误的是
A.上述获得蓝色玫瑰的方案中不需
要转入能调控液泡pH的基因
B.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限
制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C.同时使用SpeⅠ和SacⅠ能提高idgS基因和Ti质粒的重组效率
D.sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的
√
13
靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中不需要转入能调控液泡pH的基因，A正确；
将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，则会将终止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B错误。
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8.(2024·莆田高三质检)如图表示利用基因工程生产黄金大米时所构建的基因表达载体，其中基因Ⅰ和基因Ⅱ是β－胡萝卜素合成所必需的基因，基因Ⅲ表达的蛋白质可使细菌在特殊培养基上生长。下列分析错误的是
A.A序列是该基因表达载体的复
制原点
B.基因Ⅲ的作用是便于筛选该重
组质粒
C.β－胡萝卜素是检测基因Ⅰ、基因Ⅱ表达的关键指标之一
D.图中基因插入质粒时需要限制酶和DNA连接酶
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由题图可知，每个基因前都存在A序列，可推测该序列应为启动子序列，启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，一个质粒一般只有一个复制原点，A错误。
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9.(2024·南京高三联考)某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，使青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如图所示。下列有关叙述错误的是
A.也可用PCR技术直接扩增RNA来获取目的基因
B.酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键
C.本过程中，可以采用一种、两种甚至四种酶2
D.通过抗原—抗体杂交技术可检测fps基因是否表达出蛋白质
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PCR技术不能直接扩增RNA来获取目的基因，A错误；
据图可知，酶1表示逆转录酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA连接酶，酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键，B正确；
不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，因此为了成功构建表达载体，可以采用一种、两种甚至四种酶2切割含fps基因的DNA片段和质粒a，C正确。
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10.(2024·徐州高三质检)图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是
A.若通过PCR技术提取该目
的基因，应该选用引物a
和引物c
B.构建表达载体时可选用
BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶
C.若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌
D.只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞
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由于选择BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌，D错误。
根据图甲可知，BamHⅠ会导致两种抗性基因都被破坏，所以不宜选用BamHⅠ，为防止目的基因自身环化，可选用BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，B正确；
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二、非选择题
11.(2021·全国乙，38)用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
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回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，上图中_________
_______酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接，上图中_________
________________________切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
EcoRⅠ、
PstⅠ
EcoRⅠ、
PstⅠ、SmaⅠ和EcoR Ⅴ
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限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。
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(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
磷酸二酯键
DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
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(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中 ；质粒DNA分子上有 ______________________ ，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是________________________________________________
___________________________。
自我复制
一至多个限制酶切割位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即
为含有质粒载体的宿主细胞
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质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因便于重组DNA分子的筛选，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
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(4)表达载体含有启动子，启动子是指______________________________
____________________________________________________________。
位于基因上游的一段有特殊序列结
构的DNA片段，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
13
12.(2021·福建，21)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
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(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。
引物1和引物4
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密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。
13
①选用 酶将载体P切开，再用 __ (填“T4 DNA”或“E.coli81 DNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
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(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
EcoR Ⅴ
T4 DNA
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MT基因的末端为平末端，故需要用EcoR Ⅴ或SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E连接，故需将MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ两个酶切位点之间，故选EcoR Ⅴ将载体P切开；由于E.coli81 DNA连接酶只能连接黏性
末端，而T4 DNA连接酶可以连接平末端，MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
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②载体P′不具有表达MT基因的______
和 。选用 ______ 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用______离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
启动子
终止子
XhoⅠ和PstⅠ
钙
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由图可知，载体P′不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶的识别序列，故可选用限制酶XhoⅠ和PstⅠ进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。
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(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是_________________
________________________________________。
平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
尚未在个体生物学水
由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也不能说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
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13.科研人员通过转基因技术培育出超量表达P蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，含P基因的DNA片段以及Ti质粒的酶切位点如图所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。请回答下列问题：
限制酶 识别序列
ClaⅠ 5′AT↓CGAT3′
BamHⅠ 5′G↓GATCC3′
Hind Ⅲ 5′A↓AGCTT3′
EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′
KpnⅠ 5′GGTAC↓C3′
SacⅠ 5′GAGCT↓C3′
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(1)以RNA为模板，通过RT—PCR技术可获取P基因。进行RT—PCR时，一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而不是脱氧核苷酸，其原因是______________________________
_____________________________________________，同时需加入的酶有_____________
__________________。为了特异性扩增P基因序列，需根据 ________ 设计特异性引物。
dNTP 能为子链延伸过程提供能量和原料(或脱氧核苷酸只能作为原料而不能提供能量)
逆转录酶和耐
高温的DNA聚合酶
P基因两端的碱基序列
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(2)在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是 和 ，这样操作不仅使P基因在玉米植株中超量表达，还可利用T－DNA的 _____ 特性，最终使P基因_______
__________ 。
BamHⅠ
SacⅠ
可转移
玉米细胞染色体DNA上
整合到
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在构建基因表达载体时，要想使P基因在玉米植株中超量表达，切割目的基因时需要把强启动子和P基因连在一起切割下来，因此需要用到BamHⅠ切割，另一种酶可以用KpnⅠ或者SacⅠ，在质粒中，KpnⅠ识别序列在BamHⅠ识别序列的左侧，终止子在右侧，如果用KpnⅠ切割，目的基
因和质粒连接后，目的基因不在启动子和终止子之间，将来无法转录，因此在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是BamHⅠ和SacⅠ。
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(3)将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，培养基中需加入 ，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。
潮霉素
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据图可知，利用Ti质粒的T－DNA可将目的基因(P基因)转移到玉米细胞的染色体DNA上，T－DNA中含有标记基因潮霉素抗性基因，因此培养基中需加入潮霉素以便筛选转基因愈伤组织。
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(4)对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有__________________
__________________________________________________________________________________________。
基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达
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基因能控制蛋白质的合成，该过程包括转录和翻译。有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有：基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达等。
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13第61课时　基因工程的基本工具和基本操作程序
课标要求 1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展起来的。2.阐明重组DNA技术的三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序。
考情分析 1.基因工程的基本工具 2023·新课标·T6　2021·全国乙·T38　2021·湖北·T7
2.基因工程的基本操作程序 2023·全国乙·T38　2023·全国甲·T38　2023·湖北·T4　2023·广东·T20 2021·广东·T22
考点一　基因工程的基本工具
1．基因工程的概念
2．基因工程的诞生和发展
(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间转移。
(2)DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。
(3)中心法则的确立。
(4)遗传密码的破译。
(5)基因转移载体的发现。限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
(6)DNA体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9)PCR技术的发明。
(10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
提醒　①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。
③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
(3)载体
判断正误
(1)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的(　×　)
提示　基因工程是人工操作导致的基因重组，变异是定向的。
(2)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA(　×　)
提示　DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　×　)
提示　限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。
(4)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因(　×　)
提示　质粒上的抗生素抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：
(1)请用图示法写出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的过程。
提示　限制酶EcoRⅠ：
限制酶NheⅠ：
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示　用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
归纳总结　限制酶的选择
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
考向一　辨析基因工程的基本工具
1．(2021·湖北，7)限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为(　　)
A．6 B．250 C．4 000 D．24 000
答案　C
解析　据图可知，EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4 096，即4 096个碱基对可能出现一个限制酶EcoRⅠ的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4 096，与4 000最接近，C符合题意。
2．(2024·连云港高三调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　)
项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况
① 能生长 不能生长
② 能生长 能生长
③ 不能生长 能生长
A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点
B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b
C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个
D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶
答案　C
解析　质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。
归纳提升　与DNA有关的几种酶的比较
考点二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR获取和扩增目的基因
a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
b．PCR反应的条件：一定的缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。
c．PCR扩增的过程
d．PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
归纳提升　PCR技术和DNA复制的比较
③通过构建基因文库来获取目的基因。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
辨析　(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
4．目的基因的检测与鉴定
判断正误
(1)目的基因一定是编码蛋白质的基因(　×　)
提示　目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
(2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋(　√　)
(3)基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束(　×　)
提示　启动子和终止子决定着转录的开始与结束。
(4)Ti质粒上的T－DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起(　√　)
(5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(　×　)
提示　为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时能以受精卵为受体，也能以体细胞为受体。
(6)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术(　×　)
提示　检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR等技术。
1．Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。回答下列问题：
(1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？
提示　引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。
(2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗？
提示　不需要，只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。
(3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么？
提示　引物是依据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt毒蛋白基因在PCR中经过n轮循环，理论上得到多少个DNA分子？含引物的DNA分子多少个？含其中一种引物的DNA分子多少个？同时含两种引物的DNA分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？
提示　经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子 (2n－2n)个。
(5)PCR扩增Bt基因的过程中需要解旋酶吗？并说明理由。所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
提示　不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下即可完成解旋。由于PCR过程温度较高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。
2．据图分析抗虫棉的培育过程。
(1)该过程中的目的基因是Bt基因，载体是Ti质粒。
(2)基因工程中，往往使用两种限制酶切割目的基因，这样做的原因是什么？
提示　为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连接。
(3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？
提示　目的基因应插入启动子与终止子之间。
(4)该实例中，导入目的基因的方法是农杆菌转化法。为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？
提示　由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
(5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上？为什么？
提示　一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。
(6)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪些？
提示　抗原—抗体杂交、用棉叶饲喂棉铃虫。
考向二　辨析基因工程的基本操作程序
3．(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案　D
解析　若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
4．(2024·江苏扬州中学高三模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是(　　)
A．目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA
B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，没有双螺旋结构
D．可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上
答案　D
解析　在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T－DNA片段上，有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上，A错误；农杆菌侵染植物细胞不需要用Ca2＋处理，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的DNA，具有双螺旋结构，C错误。
1. (选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2．(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
3．(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
4．(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
5．(选择性必修3 P77)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
6．(选择性必修3 P80)基因表达载体的构建的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
7．(选择性必修3 P81)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
8．(选择性必修3 P81～82)将目的基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法、花粉管通道法；导入动物细胞的方法是显微注射法；导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法。
9．(选择性必修3 P82)目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
10．如图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点为：Hind Ⅲ(A↓AGCTT)、Pvit Ⅱ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcoRⅠ(G↓AATTC)、PstⅠ(CTGCA↓G)、BamHⅠ(G↓GATCC)。为使phb2基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入Pvit Ⅱ和EcoRⅠ两种不同限制酶的识别序列。将经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用T4 DNA连接酶(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
课时精练
一、选择题
1．(2024·泉州高三质检)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、Bgl Ⅱ(－A↓GATCT－)、MboⅠ(－↓GATC－)这样，识别序列不同，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是(　　)
选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析
A BclⅠ和BglⅡ BclⅠ和BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B BclⅠ和BglⅡ MboⅠ 切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化
C MboⅠ BclⅠ和BglⅡ 形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开，但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开
D MboⅠ MboⅠ 切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化
答案　B
解析　切割质粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ时，切割后产生的黏性末端相同，形成重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，A正确；用BclⅠ和BglⅡ切割质粒，切割后产生的黏性末端相同，切割后的质粒可能自我环化，B错误；切割质粒用MboⅠ，切割目的基因用BclⅠ和Bgl Ⅱ，产生相同的黏性末端，形成的重组质粒中有MboⅠ的切割位点，但不一定有BclⅠ和Bgl Ⅱ的切割位点，因此形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开，但可能无法被BclⅠ和Bgl Ⅱ再次切开，C正确；切割质粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，切割后的质粒和目的基因均可以自我环化，D正确。
2．(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
答案　C
解析　酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。
3．(2023·重庆，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)
A．其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
答案　B
解析　由于引物只能引导子链从5′端到3′端延伸，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′，A正确；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B错误；用步骤①的限制酶NheⅠ和限制酶CfoⅠ对载体(环状DNA)进行酶切，切割之后至少获得了2个片段，C正确；E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，图中酶切后形成的是黏性末端，酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，D正确。
4．(2024·镇江高三二模)转基因植物中标记基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分离剔除法和重组剔除法。分离剔除法是在转基因时将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，通过共转化得到转基因植物后让其自交得到不含标记基因的转基因个体；重组剔除法利用Cre/LoxP重组酶系统，Cre酶能有效剔除重组载体中含有标记基因的序列，只留下一个LoxP位点，具体原理如图。下列说法不正确的是(　　)
A．利用分离剔除法时，目的基因和标记基因都应插到Ti质粒的T－DNA序列内部
B．分离剔除时目的基因和标记基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上均可成功
C．上述重组载体中启动子1在农杆菌中可发挥作用，而在植物细胞中不能发挥作用
D．经重组剔除后的标记基因，因没有启动子而无法启动基因的转录
答案　C
解析　Ti质粒的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上，所以利用分离剔除法时，目的基因和标记基因都应插到Ti质粒的T－DNA序列内部，进而成功整合到受体细胞染色体DNA上，A正确；分离剔除时目的基因和标记基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上最终均可获得不含标记基因的转基因个体，即均可成功，B正确；重组剔除时，Cre酶基因应该在植物细胞中表达，故上述重组载体中启动子1在农杆菌中不能发挥作用，而在植物细胞中能发挥作用，C错误；由图可知，经重组剔除后的标记基因没有启动子，无法启动基因的转录，D正确。
5．如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是(　　)
A．过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，导致T－DNA片段失活
B．过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化
C．过程②用Ca2＋处理，使农杆菌细胞壁通透性改变，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
D．过程③应在培养基中加入除草剂和物质K
答案　D
解析　过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，不会导致T－DNA片段失活，A错误；过程①使用两种限制酶，且这两种限制酶切割产生的黏性末端不同，才可以防止酶切产物自身环化，B错误；过程③应在培养基中加入除草剂和物质K，除草剂是用来检测目的基因是否正确表达，物质K是用来检测目的基因有没有导入植物细胞中，加入除草剂可保留转化的愈伤组织和附着农杆菌但未转化的愈伤组织，其中变蓝的为转化的愈伤组织，D正确。
6．(2024·西安高三一模)我国科学家利用XbaⅠ和SacⅠ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678 bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图表示相关培育过程(质粒的其他部位和目的基因内部均无XbaⅠ、SacⅠ、Hind Ⅲ的识别位点)，下列说法不正确的是(　　)
A．一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次，共产生8个等长DNA分子
B．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法
C．植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株
D．使用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后能得到1 500 bp左右的片段
答案　C
解析　一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次共产生等长的DNA分子数24－2×4＝8(个)，A正确；因为插入植物细胞染色体上的是质粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，导入成功的植物细胞对卡那霉素无抗性，C错误；根据切割目的基因的限制酶在质粒上的切割位点，可知由于重组质粒上移除1 900 bp而补充了含678 bp的目的基因，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后，可得到822＋678＝1 500(bp)左右的新片段，D正确。
7．自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
下列相关叙述错误的是(　　)
A．上述获得蓝色玫瑰的方案中不需要转入能调控液泡pH的基因
B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C．同时使用SpeⅠ和SacⅠ能提高idgS基因和Ti质粒的重组效率
D．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的
答案　B
解析　靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中不需要转入能调控液泡pH的基因，A正确；将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，则会将终止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B错误。
8．(2024·莆田高三质检)如图表示利用基因工程生产黄金大米时所构建的基因表达载体，其中基因Ⅰ和基因Ⅱ是β－胡萝卜素合成所必需的基因，基因Ⅲ表达的蛋白质可使细菌在特殊培养基上生长。下列分析错误的是(　　)
A．A序列是该基因表达载体的复制原点
B．基因Ⅲ的作用是便于筛选该重组质粒
C．β－胡萝卜素是检测基因Ⅰ、基因Ⅱ表达的关键指标之一
D．图中基因插入质粒时需要限制酶和DNA连接酶
答案　A
解析　由题图可知，每个基因前都存在A序列，可推测该序列应为启动子序列，启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，一个质粒一般只有一个复制原点，A错误。
9．(2024·南京高三联考)某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，使青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
A．也可用PCR技术直接扩增RNA来获取目的基因
B．酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键
C．本过程中，可以采用一种、两种甚至四种酶2
D．通过抗原—抗体杂交技术可检测fps基因是否表达出蛋白质
答案　A
解析　PCR技术不能直接扩增RNA来获取目的基因，A错误；据图可知，酶1表示逆转录酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA连接酶，酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键，B正确；不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，因此为了成功构建表达载体，可以采用一种、两种甚至四种酶2切割含fps基因的DNA片段和质粒a，C正确。
10．(2024·徐州高三质检)图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是(　　)
A．若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物a和引物c
B．构建表达载体时可选用BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶
C．若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌
D．只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞
答案　D
解析　根据图甲可知，BamHⅠ会导致两种抗性基因都被破坏，所以不宜选用BamHⅠ，为防止目的基因自身环化，可选用BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，B正确；由于选择BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌，D错误。
二、非选择题
11．(2021·全国乙，38)用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接，上图中 切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是
。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指 。
答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoR Ⅴ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　(4)位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
解析　(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因便于重组DNA分子的筛选，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
12．(2021·福建，21)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用 酶将载体P切开，再用 (填“T4 DNA”或“E.coli81 DNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是
。
答案　(1)引物1和引物4　(2)①EcoR Ⅴ　T4 DNA　②启动子　终止子　XhoⅠ和PstⅠ　钙　(3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
解析　(1)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。(2)①MT基因的末端为平末端，故需要用EcoR Ⅴ或SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E连接，故需将MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ两个酶切位点之间，故选EcoR Ⅴ将载体P切开；由于E.coli81 DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶可以连接平末端，MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②由图可知，载体P′不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶的识别序列，故可选用限制酶XhoⅠ和PstⅠ进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也不能说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
13．科研人员通过转基因技术培育出超量表达P蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，含P基因的DNA片段以及Ti质粒的酶切位点如图所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。请回答下列问题：
限制酶 识别序列
ClaⅠ 5′AT↓CGAT3′
BamHⅠ 5′G↓GATCC3′
Hind Ⅲ 5′A↓AGCTT3′
EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′
KpnⅠ 5′GGTAC↓C3′
SacⅠ 5′GAGCT↓C3′
(1)以RNA为模板，通过RT—PCR技术可获取P基因。进行RT—PCR时，一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而不是脱氧核苷酸，其原因是
，
同时需加入的酶有 。为了特异性扩增P基因序列，需根据 设计特异性引物。
(2)在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是 和 ，这样操作不仅使P基因在玉米植株中超量表达，还可利用T－DNA的 特性，最终使P基因 。
(3)将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，培养基中需加入 ，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。
(4)对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有
。
答案　(1)dNTP 能为子链延伸过程提供能量和原料(或脱氧核苷酸只能作为原料而不能提供能量)　逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶　P基因两端的碱基序列　(2)BamHⅠ　SacⅠ　可转移　整合到玉米细胞染色体DNA上　(3)潮霉素　(4)基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达
解析　(2)在构建基因表达载体时，要想使P基因在玉米植株中超量表达，切割目的基因时需要把强启动子和P基因连在一起切割下来，因此需要用到BamHⅠ切割，另一种酶可以用KpnⅠ或者SacⅠ，在质粒中，KpnⅠ识别序列在BamHⅠ识别序列的左侧，终止子在右侧，如果用KpnⅠ切割，目的基因和质粒连接后，目的基因不在启动子和终止子之间，将来无法转录，因此在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是BamHⅠ和SacⅠ。(3)据图可知，利用Ti质粒的T－DNA可将目的基因(P基因)转移到玉米细胞的染色体DNA上，T－DNA中含有标记基因潮霉素抗性基因，因此培养基中需加入潮霉素以便筛选转基因愈伤组织。(4)基因能控制蛋白质的合成，该过程包括转录和翻译。有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有：基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达等。

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