资源简介

(共73张PPT)
专题突破10
综合PCR的基因工程问题
阐述常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR等的过程与原理，举例说明不同的PCR技术有着不同的应用。
课标要求
考情分析
几种不同PCR的应用 2023·江苏·T22　2023·山东·T25　2022·江苏·T24　2022·山东·T25
2021·全国甲·T38　2021·山东·T25　2020·北京·T12　2020·江苏·T33
类型一　利用PCR技术获取目的基因
基本模型
获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。
典例突破
1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是
典例突破
A.第一轮复制得到2个DNA分子，即
　①②各一个
B.第二轮复制得到4个DNA分子，即
　①②③④各一个
C.第四轮复制得到16个DNA分子，其
　中有4个X基因
D.经五轮循环后产物中有五种不同的
　DNA分子
√
据图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各一个，A正确；
第二轮复制得到22＝4(个)DNA分子，即①复制得①和③、②复制得②和④，即得到①②③④各一个，B正确；
典例突破
第四轮复制得到16个DNA分子，其中有8个⑤(X基因)，C错误；
经五轮循环后共形成32个DNA分子，其中①②各一个，③④各四个，22个⑤，故产物中有五种不同的DNA分子，D正确。
典例突破
类型二　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
基本模型
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
2.(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择
的一对引物是________。某学生尝试用图中另外
一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp
片段，原因是____________________。
乙、丙
目的基因反向连接
典例突破
分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不
同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。
典例突破
重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
类型三　利用PCR技术引导基因定点突变
基本模型
3.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
典例突破
注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过_________
________________来完成。
(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为_______(假设引物为单链DNA)。
典例突破
改造基因
(或基因定点突变)
T－A或C－G
A或G
若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A或C－G，对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖氨酸。
典例突破
(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_______________________________
________________________________________。
典例突破
3
引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用
若两个反应系统均进行一次复制， 则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。
典例突破
(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是______________________________________________________________。
典例突破
M1、M2中的一种引物与N1、N2中的
一种引物必须具有互补配对的片段
重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，设计引物时需要注意的是，需要找到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。
典例突破
利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。
类型四　利用PCR技术扩增未知基因序列
基本模型
4.(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
典例突破
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种________
_______________酶，它通过识别特定的____________切割特定位点。
限制性内
切核酸(或限制)
核苷酸序列
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成_____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化_______
_______________________。
典例突破
磷酸二酯键
DNA单链
以DNA
为模板的DNA链的延伸
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
典例突破
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
②④
典例突破
PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合，向右侧方向延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合，向左侧方向延伸形成子链，该引物是②。
病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。
类型五　利用PCR技术快速检测病原体
基本模型
5.(2024·烟台高三一模)人类猴痘由Yaba猴病毒(双链DNA病毒)引起，实时荧光定量PCR(qPCR)可用于Yaba 猴病毒的快速检测。进行qPCR 时，在反应体系加入Taq man探针，Taq man探针两端连有荧光基团(R)和抑制荧光发出的淬灭基团(Q)，完整的Taq man探针不发出荧光，当探针被水解后R基团会发出荧光(如图所示)，随循环次数的增加，荧光信号强度增加。
典例突破
(1)采用 qPCR 检测Yaba 猴病毒需在一定的______溶液中才能进行，反应体系中还需提供DNA模板、原料、______、Taq man探针、Taq DNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR过程中，Taq DNA 聚合酶的两个作用是_____________
____________________。
典例突破
缓冲
引物
催化合成DNA
子链；催化探针水解
(2)qPCR检测病毒的核酸一般具有特异性强和灵敏度高的特点，这与反应体系中加入的______和______有关。但有时也可能会出现“假阴性”的结果。可能的原因有_________
_____________________________________________(答出两点)。
典例突破
引物
探针
取样不规
范；取样所获样本量不足；病毒发生了基因
突变
(3)在PCR反应体系中一般都要加入Mg2＋，原因是____________________________。为了探究Mg2＋对PCR扩增效果的影响，科研人员在PCR反应体系中加入不同浓度的Mg2＋进行了实验。结果如图所示，据此可得出的结论有_____________________________________
典例突破
TaqDNA聚合酶需要Mg2＋激活
在不含 Mg2＋的缓冲液中靶基因几乎无法
_______________________________________________________________
_____________________。
扩增；在不同浓度的Mg2＋缓冲液中靶基因的扩增效果不同；在实验浓度下，4 mM 为最佳浓度
真核细胞和细菌的DNA聚合酶(TaqDNA 聚合酶)都需要Mg2＋激活；分析题图可知，⑥为阴性对照组，其荧光强度非常弱，意味着不加 Mg2＋的缓冲液中靶基因几乎无法扩增；而加了不同浓度的Mg2＋的缓冲液对应的曲线①
②③④⑤荧光强度均高于⑥，且③曲线(Mg2＋浓度为4 mM)的峰值对应的荧光强度最高，说明在不同浓度的Mg2＋缓冲液中靶基因的扩增效果不同；在实验浓度下，4 mM为最佳浓度。
典例突破
课时精练
一、选择题
1.(2024·厦门高三质检)如图表示 PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正确的是
A.②链从L到R的方向为3′→5′，
①②链均可作为子链合成的模板
B.PCR 过程需要通过解旋酶断开氢
键，且为边解旋边复制
C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③
D.物质③的5′端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双
链产物
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根据DNA分子中两条链的反向平行
关系可判断，②链从L到R的方向为
5′→3′，A错误；
PCR过程是通过高温将双链DNA之间的氢键断开，并且是全部解旋之后才进行复制，B错误；
以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23＝8，需消耗7个引物③，C错误。
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2.(2024·重庆高三质检)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是
A.用不对称PCR方法扩增目的基因时，
不需要知道基因的全部序列
B.进行最初若干次循环的目的是增加
模板DNA的量
C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链
的碱基序列一致
D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
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不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物是与乙链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误。
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3.(2024·无锡高三模拟)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是
A.过程①需要把两对引物同时加入一
个扩增体系以提高扩增效率
B.过程①需要2轮PCR才能得到图中所
示PCR产物
C.过程②的产物都可以完成延伸过程
D.若过程④得到16个突变基因则需要
消耗15个通用引物RP2
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两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；
过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C错误；
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若过程④得到16个突变基因，由于模板中不含有通用引物，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15(个)，D正确。
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4.反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述不正确的是
A.过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割
B.过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二酯键
C.过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合酶
和解旋酶
D.该技术可检测T－DNA整合到植物染色体DNA
的位置
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过程③即PCR扩增，PCR技术中DNA解旋是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，C错误。
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5.IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，如图所示。下列说法错误的是
A.PCR1中使用的引物有引物A、引物C
B.PCR2中使用的引物有引物B、大引物b链
C.PCR1过程需要扩增3轮才能获得目标产物
D.PCR2过程中，为减少错误DNA片段的产生
可适当升高复性温度
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在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，在基因的左侧需要用限制酶Hind Ⅲ来切割，在基因的右侧用限制酶SacⅠ切割，因此在PCR1中结合到基因右端的引物选择引物C，从题图中看，另一个引物应含有突变碱基C，所以选择引物A，A正确；
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在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，应含有限制酶Hind Ⅲ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′端到3′端的序列中开始部位应含有Sac Ⅰ识别的序列，从图中看，它是大引物的b链，B正确；
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PCR1过程主要是为了获得大引物，则扩增2轮即可获得目标产物，C错误；
由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目的基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高温度，便于引物与模板链的结合，D正确。
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6.(2024·安顺高三调研)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列相关叙述错误的是
A.PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结
合)、延伸3个阶段
B.耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形
成磷酸二酯键
C.最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本
DNA的含量呈正相关
D.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
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Ct值越小，说明所需循环的次数越少，被检测样本中病毒数目越多，D错误。
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7.(2024·襄阳高三模拟)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述不正确的是
A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的
基因定向插入
B.复性温度过高会导致引物不能与模板牢固结
合，PCR扩增效率下降
C.第3轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成
两条链等长的突变基因
D.第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等
长的DNA占1/2
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引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向插入载体，避免发生自身连接，A正确；
PCR技术中，复性温度过高会导致引物不能与互补DNA链(模板)牢固结合，PCR扩增效率下降，B正确；
第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有1个，而子代DNA有23＝8(个)，故含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8，D错误。
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8.(2024·南通高三调研)如图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T－DNA插入的具体位置。下列有关说法错误的是
A.农杆菌在自然条件下主
要侵染双子叶植物和裸
子植物，T－DNA存在于其Ti质粒上
B.利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列
C.若扩增循环n次，需要2n＋1－2个引物
D.将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T－DNA的插入位置
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农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力，A正确；
耐高温的DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子链，因此利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，B错误；
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扩增循环n次，得到2n个DNA分子，总单链数为2×2n即2n＋1条，只有最初的2条母链不需要引物，因此共需要2n＋1－2个引物，C正确；
不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T－DNA的插入位置，D正确。
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9.实时荧光定量RT－PCR技术需要在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光探针，荧光染料能特异性掺入DNA双链中，从而发出荧光信号。在流感流行季节，对怀疑流感病毒感染的患者，可以通过实时荧光定量RT－PCR技术进行核酸检测。下列相关叙述不正确的是
A.图中的探针可能是利用荧光分子标记的流感
病毒独特的基因序列
B.核酸检测是通过检测荧光信号来确定样本中
是否有病毒核酸的
C.PCR技术利用了DNA双链复制的原理，需要
解旋酶和耐高温的DNA聚合酶的催化
D.用荧光RT－PCR技术测定病毒的核酸具有特异性
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PCR技术利用了DNA双链复制的原理，不需要解旋酶，可通过高温使DNA双链解开，但需要耐高温的DNA聚合酶的催化，C错误。
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二、非选择题
10.(2023·江苏，22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1
所示。请回答下列问题：
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(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______________，扩增程序中最主要的不同是______
______。
模板、引物
引物的
设计
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PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过
程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最主要因素。
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(2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______________________。
限制酶、(T4)DNA连接酶
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传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒，使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与
线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)。
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(3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A.稀释涂布平板需控制每个平
板30～300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原
因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量
杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
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用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误；
培养基冷却后才接种，故抗性平板上未长出菌落不是因为培养基温度太高，B错误；
转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；
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稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法接种后在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。
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(4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
P3、P4
EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720＋390＝
1 100(bp)，用引物F1－F和F2－R进行PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
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(5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_____
___________________________________________________________________。
电泳
只能检测DNA分子的大小(长度)，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
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11.基因工程在农业方面的应用发展迅速，我国转基因作物的种植面积在世界有较高排名。请回答下列相关问题：
(1)目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能，目的基因往往从相关的______________________的基因中进行筛选。
已知结构和功能清晰
(2)目的基因可以人工合成、从基因文库中获取，还可以利用PCR技术获取和扩增。如图1展示了PCR技术获取和扩增目的基因的原理，请分析回答下列问题：
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①PCR技术利用了DNA半保留复制原理和______________原理。PCR的一次循环包括变性、复性和延伸三个过程，复性的作用是_____________
__________________________。
②将一个DNA分子进行扩增，理论上目的基因最早在第____次循环后获得；第5次循环后，可扩增得到______个目的基因。
碱基互补配对
使引物通过碱
基互补配对与两条单链结合
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(3)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如图所示。图中链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。请回答相关问题：
①EcoR Ⅰ酶切后得到的—AATT称为黏性末端，“黏性”的含义是___________________
_________________________，EcoR Ⅰ切割得到黏性末端的原
两个末端互补的碱基
之间可以自发形成氢键
因是_________________________________。
切割位点在识别序列中心轴线两侧
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②不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是_______________________
__________。
DNA两端序列未知，无法
设计引物
③图4中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是_______(填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物______(填“含有”或“不含”)EcoR Ⅰ的酶切位点。
逆时针
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含有
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12.(2024·湖北华中师大附中高三模拟)幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性而参与调控其致病性。为了更准确地分离出MreB蛋白，用重叠延伸PCR技术(指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术)，将幽门螺杆菌MreB基因中编码终止密码子前的DNA序列与TAP标签(可以标记幽门螺杆菌基因组中任何一个基因，且不会影响基因的表达)进行连接，构建了融合表达蛋白MreB和TAP标签的质粒，
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实验流程如图所示。据图回答下列问题：
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(1)重叠PCR获得带有标签的MreB基因
①获得两种具有重叠片段DNA的过程中，PCR1和PCR2必须在不同的反应体系中，原因是_______________________________________________
__________________________________。
引物2和引物3中存在互补配对的片段，置于同一反应
体系时，它们会发生结合而失去作用
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重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术，引物2和引物3中存在互补配对的片段，置于同一反应体系时，它们会发生结合而失去作用。
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②PCR3反应体系中所加入的引物是______________。
引物1、引物4
分析题意可知，PCR3是为了获得带有标签的MreB基因，所以应选择引物1和引物4。
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(2)重组质粒的构建
①为将带有标签的MreB基因定向插入到pK18mobSacB质粒中，需要在引物末端添加限制酶识别序列，据图分析，在引物1添加的序列所对应的限制酶是________，在引物
SmaⅠ
4添加的序列所对应的限制酶是_______。经过这两种酶酶切的带有标签的MreB基因和pK18mobSacB质粒进行连接时，可选用______________
(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
XhoⅠ
T4 DNA连接酶
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要将带有标签的MreB基因定向插入到pK18mobSacB质粒中的启动子与终止子之间，EcoR Ⅰ在启动子两侧均有其切割位点，因此不能选择EcoRⅠ，在引物1添加的序列所对应的限制酶只能是SmaⅠ，在引物4添加的序
列所对应的限制酶只能是XhoⅠ；SmaⅠ切割后产生平末端，经过这两种酶酶切的带有标签的MreB基因和pK18mobSacB质粒进行连接时应选择T4 DNA连接酶。
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②重组质粒中，KmR基因的作用是________________________________
_________________________________。
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
重组质粒中，KmR基因是标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
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12专题突破10　综合PCR的基因工程问题
课标要求 阐述常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR等的过程与原理，举例说明不同的PCR技术有着不同的应用。
考情分析 几种不同PCR的应用 2023·江苏·T22　2023·山东·T25　2022·江苏·T24　2022·山东·T25 2021·全国甲·T38　2021·山东·T25　2020·北京·T12　2020·江苏·T33
　　　　　　　　　　　　　　　　
类型一　利用PCR技术获取目的基因
基本模型
获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。
典例突破
1．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是(　　)
A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
D．经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子
答案　C
解析　据图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各一个，A正确；第二轮复制得到22＝4(个)DNA分子，即①复制得①和③、②复制得②和④，即得到①②③④各一个，B正确；第四轮复制得到16个DNA分子，其中有8个⑤(X基因)，C错误；经五轮循环后共形成32个DNA分子，其中①②各一个，③④各四个，22个⑤，故产物中有五种不同的DNA分子，D正确。
类型二　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
基本模型
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
典例突破
2．(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是____________________。
答案　乙、丙　目的基因反向连接
解析　分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。
类型三　利用PCR技术引导基因定点突变
基本模型
重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
典例突破
3．水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________来完成。
(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链DNA)。
(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_______________________________
______________________________________________________________________________。
(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是__________________________________________________
______________________________________________________________________________。
答案　(1)改造基因(或基因定点突变)　(2)T－A或C－G　A或G　(3)3　引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用
(4)M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段
解析　(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A或C－G，对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖氨酸。(3)若两个反应系统均进行一次复制， 则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，设计引物时需要注意的是，需要找到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。
类型四　利用PCR技术扩增未知基因序列
基本模型
利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。
典例突破
4．(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种________________酶，它通过识别特定的________________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化
________________________________________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
答案　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列
(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④
解析　(3)PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合，向右侧方向延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合，向左侧方向延伸形成子链，该引物是②。
类型五　利用PCR技术快速检测病原体
基本模型
病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。
典例突破
5．(2024·烟台高三一模)人类猴痘由Yaba猴病毒(双链DNA病毒)引起，实时荧光定量PCR(qPCR)可用于Yaba 猴病毒的快速检测。进行qPCR 时，在反应体系加入 Taq man探针，Taq man探针两端连有荧光基团(R)和抑制荧光发出的淬灭基团(Q)，完整的Taq man探针不发出荧光，当探针被水解后R基团会发出荧光(如图所示)，随循环次数的增加，荧光信号强度增加。
(1)采用 qPCR 检测Yaba 猴病毒需在一定的__________溶液中才能进行，反应体系中还需提供DNA模板、原料、__________、Taq man探针、Taq DNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR过程中，Taq DNA 聚合酶的两个作用是____________________________________________________。
(2)qPCR检测病毒的核酸一般具有特异性强和灵敏度高的特点，这与反应体系中加入的__________和__________有关。但有时也可能会出现“假阴性”的结果。可能的原因有______________________________________________________________________________
____________________________________________________________________(答出两点)。
(3)在PCR反应体系中一般都要加入Mg2＋，原因是____________________________。为了探究Mg2＋对PCR扩增效果的影响，科研人员在PCR反应体系中加入不同浓度的Mg2＋进行了实验。结果如图所示，据此可得出的结论有_______________________________________
______________________________________________________________________________。
答案　(1)缓冲　引物　催化合成DNA子链；催化探针水解　(2)引物　探针　取样不规范；取样所获样本量不足；病毒发生了基因突变　(3)TaqDNA聚合酶需要Mg2＋激活　在不含 Mg2＋的缓冲液中靶基因几乎无法扩增；在不同浓度的Mg2＋缓冲液中靶基因的扩增效果不同；在实验浓度下，4 mM 为最佳浓度
解析　(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶(TaqDNA 聚合酶)都需要Mg2＋激活；分析题图可知，⑥为阴性对照组，其荧光强度非常弱，意味着不加 Mg2＋的缓冲液中靶基因几乎无法扩增；而加了不同浓度的Mg2＋的缓冲液对应的曲线①②③④⑤荧光强度均高于⑥，且③曲线(Mg2＋浓度为4 mM)的峰值对应的荧光强度最高，说明在不同浓度的Mg2＋缓冲液中靶基因的扩增效果不同；在实验浓度下，4 mM为最佳浓度。
课时精练
一、选择题
1．(2024·厦门高三质检)如图表示 PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正确的是(　　)
A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
B．PCR 过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制
C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③
D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物
答案　D
解析　根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5′→3′，A错误；PCR过程是通过高温将双链DNA之间的氢键断开，并且是全部解旋之后才进行复制，B错误；以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23＝8，需消耗7个引物③，C错误。
2．(2024·重庆高三质检)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是(　　)
A．用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列
B．进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量
C．最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致
D．因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
答案　C
解析　不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物是与乙链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误。
3．(2024·无锡高三模拟)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是(　　)
A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个通用引物RP2
答案　D
解析　两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C错误；若过程④得到16个突变基因，由于模板中不含有通用引物，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15(个)，D正确。
4．反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述不正确的是(　　)
A．过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割
B．过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二酯键
C．过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合酶和解旋酶
D．该技术可检测T－DNA整合到植物染色体DNA的位置
答案　C
解析　过程③即PCR扩增，PCR技术中DNA解旋是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，C错误。
5．IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，如图所示。下列说法错误的是(　　)
A．PCR1中使用的引物有引物A、引物C
B．PCR2中使用的引物有引物B、大引物b链
C．PCR1过程需要扩增3轮才能获得目标产物
D．PCR2过程中，为减少错误DNA片段的产生可适当升高复性温度
答案　C
解析　在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，在基因的左侧需要用限制酶Hind Ⅲ来切割，在基因的右侧用限制酶Sac Ⅰ切割，因此在PCR1中结合到基因右端的引物选择引物C，从题图中看，另一个引物应含有突变碱基C，所以选择引物A，A正确；在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，应含有限制酶Hind Ⅲ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′端到3′端的序列中开始部位应含有Sac Ⅰ识别的序列，从图中看，它是大引物的b链，B正确；PCR1过程主要是为了获得大引物，则扩增2轮即可获得目标产物，C错误；由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目的基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高温度，便于引物与模板链的结合，D正确。
6.(2024·安顺高三调研)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列相关叙述错误的是(　　)
A．PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段
B．耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形成磷酸二酯键
C．最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关
D．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
答案　D
解析　Ct值越小，说明所需循环的次数越少，被检测样本中病毒数目越多，D错误。
7．(2024·襄阳高三模拟)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述不正确的是(　　)
A．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入
B．复性温度过高会导致引物不能与模板牢固结合，PCR扩增效率下降
C．第3轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2
答案　D
解析　引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向插入载体，避免发生自身连接，A正确；PCR技术中，复性温度过高会导致引物不能与互补DNA链(模板)牢固结合，PCR扩增效率下降，B正确；第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有1个，而子代DNA有23＝8(个)，故含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8，D错误。
8．(2024·南通高三调研)如图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T－DNA插入的具体位置。下列有关说法错误的是(　　)
A．农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，T－DNA存在于其Ti质粒上
B．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列
C．若扩增循环n次，需要2n＋1－2个引物
D．将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T－DNA的插入位置
答案　B
解析　农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力，A正确；耐高温的DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子链，因此利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，B错误；扩增循环n次，得到2n个DNA分子，总单链数为2×2n即2n＋1条，只有最初的2条母链不需要引物，因此共需要2n＋1－2个引物，C正确；不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T－DNA的插入位置，D正确。
9．实时荧光定量RT－PCR技术需要在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光探针，荧光染料能特异性掺入DNA双链中，从而发出荧光信号。在流感流行季节，对怀疑流感病毒感染的患者，可以通过实时荧光定量RT－PCR技术进行核酸检测。下列相关叙述不正确的是(　　)
A．图中的探针可能是利用荧光分子标记的流感病毒独特的基因序列
B．核酸检测是通过检测荧光信号来确定样本中是否有病毒核酸的
C．PCR技术利用了DNA双链复制的原理，需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶的催化
D．用荧光RT－PCR技术测定病毒的核酸具有特异性
答案　C
解析　PCR技术利用了DNA双链复制的原理，不需要解旋酶，可通过高温使DNA双链解开，但需要耐高温的DNA聚合酶的催化，C错误。
二、非选择题
10．(2023·江苏，22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______________，扩增程序中最主要的不同是________________。
(2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有__________________。
(3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有______________。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
(5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
答案　(1)模板、引物　引物的设计　(2)限制酶、(T4)DNA连接酶　(3)ABC　(4)P3、P4　(5)电泳只能检测DNA分子的大小(长度)，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
解析　(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最主要因素。(2)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒，使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)。(3)用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误；培养基冷却后才接种，故抗性平板上未长出菌落不是因为培养基温度太高，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法接种后在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。(4)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720＋390＝1 100(bp)，用引物F1－F和F2－R进行PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(5)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
11．基因工程在农业方面的应用发展迅速，我国转基因作物的种植面积在世界有较高排名。请回答下列相关问题：
(1)目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能，目的基因往往从相关的______________________的基因中进行筛选。
(2)目的基因可以人工合成、从基因文库中获取，还可以利用PCR技术获取和扩增。如图1展示了PCR技术获取和扩增目的基因的原理，请分析回答下列问题：
①PCR技术利用了DNA半保留复制原理和______________原理。PCR的一次循环包括变性、复性和延伸三个过程，复性的作用是____________________________。
②将一个DNA分子进行扩增，理论上目的基因最早在第______次循环后获得；第5次循环后，可扩增得到______个目的基因。
(3)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如图所示。图中链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。请回答相关问题：
①EcoR Ⅰ酶切后得到的—AATT称为黏性末端，“黏性”的含义是____________，EcoR Ⅰ切割得到黏性末端的原因是_______________________________________________________
______________________________________________________________________________。
②不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是_______________________。
③图4中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是______(填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物______(填“含有”或“不含”)EcoR Ⅰ的酶切位点。
答案　(1)已知结构和功能清晰　(2)①碱基互补配对　使引物通过碱基互补配对与两条单链结合　②3　22　(3)①两个末端互补的碱基之间可以自发形成氢键　切割位点在识别序列中心轴线两侧　②DNA两端序列未知，无法设计引物　③逆时针　含有
12．(2024·湖北华中师大附中高三模拟)幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性而参与调控其致病性。为了更准确地分离出MreB蛋白，用重叠延伸PCR技术(指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术)，将幽门螺杆菌MreB基因中编码终止密码子前的DNA序列与TAP标签(可以标记幽门螺杆菌基因组中任何一个基因，且不会影响基因的表达)进行连接，构建了融合表达蛋白MreB和TAP标签的质粒，实验流程如图所示。据图回答下列问题：
(1)重叠PCR获得带有标签的MreB基因
①获得两种具有重叠片段DNA的过程中，PCR1和PCR2必须在不同的反应体系中，原因是____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
②PCR3反应体系中所加入的引物是__________________。
(2)重组质粒的构建
①为将带有标签的MreB基因定向插入到pK18mobSacB质粒中，需要在引物末端添加限制酶识别序列，据图分析，在引物1添加的序列所对应的限制酶是________________，在引物4添加的序列所对应的限制酶是______________。经过这两种酶酶切的带有标签的MreB基因和pK18mobSacB质粒进行连接时，可选用______________________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
②重组质粒中，KmR基因的作用是_______________________________________________
____________________________________________________________________________。
答案　(1)①引物2和引物3中存在互补配对的片段，置于同一反应体系时，它们会发生结合而失去作用　②引物1、引物4　(2)①SmaⅠ　XhoⅠ　T4 DNA连接酶　②鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
解析　(1)①重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术，引物2和引物3中存在互补配对的片段，置于同一反应体系时，它们会发生结合而失去作用。②分析题意可知，PCR3是为了获得带有标签的MreB基因，所以应选择引物1和引物4。(2)①要将带有标签的MreB基因定向插入到pK18mobSacB质粒中的启动子与终止子之间，EcoR Ⅰ在启动子两侧均有其切割位点，因此不能选择EcoR Ⅰ，在引物1添加的序列所对应的限制酶只能是SmaⅠ，在引物4添加的序列所对应的限制酶只能是XhoⅠ；SmaⅠ切割后产生平末端，经过这两种酶酶切的带有标签的MreB基因和pK18mobSacB质粒进行连接时应选择T4 DNA连接酶。②重组质粒中，KmR基因是标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

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