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第3章 第1节　重组DNA技术的基本工具
课标内容要求
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
核心素养对接
1.科学思维：模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。
2．社会责任：关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。
自主学习
一、基因工程及其诞生与发展
1．基因工程的概念 (1)操作场所： 。 (2)操作技术： 等技术。
(3)操作结果：赋予生物新的 ，创造出更符合人们需要的新的 和生物产品。
(4)操作水平： 水平。
2．基因工程的诞生和发展
(1)基因工程的诞生
①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验证明了 ，还证明了
。
②1953年，沃森和克里克建立了 模型并提出了 的假说。
③1961年，尼伦伯格和马太破译了 。
④20世纪70年代初， 、 和 被相继发现，为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
⑤1973年，科学家证明 可以作为基因工程的载体，构建 ，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。
(2)基因工程的发展
①1982年，第一个基因工程药物—— 被批准上市。
②1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出 。
③1985年，穆里斯等人发明 ，为获取目的基因提供了有效手段。
④1990年， 计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。
⑤21世纪以来，科学家发明了多种 ，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因序列的了解。
⑥2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的 技术编辑了哺乳动物基因组。
二、DNA重组技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(又称限制酶)—“分子手术刀”
(1)来源：主要来自 。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定 ，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 键断开。
(3)结果：产生 。
(4)应用：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的 不同，切割位点 (填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有 。
2．DNA连接酶—“分子缝合针”
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
(2)种类[填表]
种类 比较 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
特点 只能连接 既可以连接黏性末端，又可以连接
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)质粒
①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于 之外，并具有 能力的环状双链DNA分子。
②质粒适于作基因运载体的特点
Ⅰ.质粒分子上有一个至多个 位点，供外源DNA片段插入其中。
Ⅱ.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中 ，或 上，
同步复制。
Ⅲ.人工改造的质粒常带有 ，便于 。
(2)噬菌体、动植物病毒等。
三、重组DNA分子的模拟操作
1．材料用具：剪刀代表EcoR_Ⅰ，透明胶条代表 。
2．切割位点
(1)分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出 序列，并选 之间作切口进行“切割”。
(2)再从另一条链上 之间寻找EcoR Ⅰ相应的切口剪开。
3．操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能 ；否则，说明操作有误。
四、DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
(1) 不溶于酒精， 溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于 溶液。
(3)在一定温度下，DNA 试剂会呈现蓝色。
2．实验步骤
(1)称取30 g洋葱，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
↓
(2)漏斗中垫 ，将研磨液过滤到烧杯中， ℃处理，取上清液。
↓
(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的 溶液，静置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
↓
(4)取两支20 ml的试管编号A、B，各加入2 mol/L的 溶液5 mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4 mL的 。混匀后，将试管置于沸水中加热5 min。
↓
(5)结果观察：A试管 ，B试管 。
基础诊断
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。 ( )
2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。 ( )
提示：DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，没有DNA聚合酶。
3．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。 ( )
提示：限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源DNA，使之失效，从而保护自身。
4．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。 ( )
5．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。 ( )
提示：E.coli DNA连接酶不能连接平末端。
6．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。 ( )
核心突破
　基因工程的工具酶
1．限制性内切核酸酶
(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面
①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。 ②能够切割特定序列中的特定位点。
(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。
(3)作用产物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：
②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：
2．限制性内切核酸酶与DNA连接酶的关系
(1)区别：
作用 应用
限制性内切核酸酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体
DNA连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于目的基因和载体的连接
(2)两者的关系可表示为：
3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
比较项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成
不同点 是否需要模板 不需要 需要
接DNA链 双链 单链
作用过程 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键
作用结果 将已存在的DNA片段连接 合成新的DNA分子
用途 基因工程 DNA复制
合作探究：(1)为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
(2)限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？
提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。
练习一：
1．限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示，下列有关说法正确的是(　　)
A．一个DNA分子中，酶a与酶b的识别序列可能有多个
B．酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接
C．酶a与酶b切断的化学键不完全相同
D．用酶a切割有3个识别位点的质粒，得到4种切割产物
2．下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是(　　)
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E.coli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸
3．下列关于几种酶作用的叙述，错误的是(　　)
A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接
B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录
C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因
D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链
　基因工程中的载体
1．种类
(1)常用载体：质粒，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
(2)其他载体：噬菌体、动植物病毒等。
2．具备条件
(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。
(3)具有标记基因：具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
说明：一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。
3．作用
(1)用它作为运输工具，将目的基因送入受体细胞中。
(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
合作探究：1.细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。
(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
2．标记基因标记的原理是什么？
提示：(1)前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
(2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。
(3)结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
原理如图所示：
练习二：
1．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是(　　)
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择
2．限制酶Mun Ⅰ和限制酶EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是。下图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是(　　)
A　[用限制酶Mun Ⅰ切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体。C、D质粒含有标记基因，但用限制酶切割后会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体。]
3．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有___(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_________；并且__________和_________的细胞也是不能区分的，其原因是______________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________。
[课堂小结]
课堂检测
1．下列对基因工程的说法，错误的是(　　)
A．基因工程是在分子水平上进行设计和施工
B．基因工程产生的变异属于染色体变异
C．基因工程可以导入不同种生物的基因
D．基因工程可定向改变生物性状
2．“分子缝合针”——DNA连接酶“缝合”的部位是(　　)
A．碱基对之间的氢键 B．碱基与脱氧核糖
C．双链DNA片段间的磷酸二酯键 D．脱氧核糖与脱氧核糖
3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是(　　)
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核(区)外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制
4．下列是基因工程的有关问题，请回答：
(1)限制性内切核酸酶可以识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的________(填化学键名称)断裂，形成的末端总体可分为两种类型，分别是________________。
(2)目的基因和载体重组时需要的工具酶是________，与限制性内切核酸酶相比，它对所重组的DNA
答 案
一、1． (1)生物体外。 (2)转基因 (3)遗传特性 生物类型 (4) DNA分子
2．(1) ①遗传物质是DNA DNA可以在同种生物的不同个体之间转移
②DNA双螺旋结构 遗传物质自我复制 ③第一个编码氨基酸的密码子
④多种限制酶、DNA连接酶 逆转录酶 ⑤质粒 重组DNA
(2) ①重组人胰岛素 ②世界上第一条转基因鱼 ③PCR
④人类基因组 ⑤高通量测序技术 ⑥基因组编辑
二、1．(1)原核生物 (2)核苷酸序列 磷酸二酯键
(3)黏性末端或平末端 (4)碱基序列 不同 专一性
2．(1)磷酸二酯键 (2) ①大肠杆菌 ②T4噬菌体 ③黏性末端 ④平末端
3.(1)质粒①真核细胞的细胞核或原核细胞拟核DNA 自我复制
②Ⅰ.限制酶切割 Ⅱ.进行自我复制 整合到受体DNA上 随受体细胞DNA
Ⅲ.标记基因 重组DNA分子的筛选
三、1． DNA连接酶 2．(1) G—A—A—T—T—C G—A (2)互补的碱基
3．互补配对
四、1．(1)DNA 蛋白质 (2) 2_mol/L的NaCl (3)遇二苯胺
2.(2)纱布 4 (3)酒精 (4) NaCl 二苯胺试剂 沸水 (5)不变蓝 变蓝色
基础诊断：1．√ 2.× 3.× 4.√ 5.× 6.√
练习一：1．A 2.C 3.C
练习二：1．A 2.A 3. (1)能自我复制、具有标记基因　 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　 含有质粒载体　 含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 　四环素　(3)受体细胞
课堂检测：1．B 2.C 3.A
4. (1)磷酸二酯键　 黏性末端和平末端　 (2)DNA连接酶 　 无
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