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1.2.2微生物的选择培养与计数学案
【预习新知】
（一）选择培养基
1.自然界中目的菌的筛选：从目的菌株生存的 中找。
(1)实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，是从热泉中筛选出来的
中提取出来的。
(2)依据：水生栖热菌能在 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
2.选择培养基：允许 的微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基。
3.实验室中目的菌的筛选
(1)原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时 其他微生物的生长。
(2)方法：利用 培养基分离。
（二）微生物的选择培养
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌
原理：通过对土样进行充分 ，再将 涂布到制备好的培养基上，即可得到能分解尿素的细菌的 。
稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列 稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到 的 ，进行培养。
1、稀释涂布平板法的操作过程
①铲取土样，将样品装入纸袋中。（取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要 ）。
②将10g土样加入盛有90mL 的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次 稀释。
③取0.1mL菌液，滴加到 。
④将 浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上 ，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将 均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
2、菌种培养
待涂布的菌液被培养基吸收后，将 ，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
3、菌种观察
在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的 。
（三）微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个________。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少________。
(2)计数原则：一般选择菌落数为________的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下，应至少对____个平板进行重复计数，然后求出________。
(3)注意事项：统计的菌落数往往比活菌的实际数目____，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是________菌落。因此，统计结果一般用________而不是活菌数来表示。
2．显微镜直接计数法
一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是________________的总和。
3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)________取样：从肥沃、湿润的土壤中，用________铁铲铲去表层土，迅速取土壤并装入________纸袋密封。
↓
(2)配制培养基：制备以________为唯一氮源的选择培养基。
↓
(3)样品的________：在火焰旁称取土壤10 g，放入盛有90 mL 无菌水的锥形瓶中，振摇使土样与水充分混合，将菌分散。制成101倍土壤稀释液，从中吸取1 mL 土壤悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍土壤稀释液，以此类推，制成103、____、____、____倍土壤稀释液。
↓
(4)取样涂布：取9个上述选择培养基分成3组，并做好标记，然后分别从104、105、106倍的三种土壤稀释液中吸取0.1 mL对号放入已做好标记的平板中，用____________在培养基表面轻轻地涂布均匀。
↓
(5)培养观察：将培养基平板倒置于________的恒温培养箱中培养1～2 d，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目________时的记录作为结果。
【巩固训练】
1.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，错误的是( )
A.可以在长期使用尿素肥料的农田土壤中采集土样
B.分离菌种所采用的培养基需添加尿素为唯一氮源
C.利用稀释涂布平板法纯化菌种时常用菌落数作为统计结果
D.实施本实验时所用平板和试管的数目不多而且耗时也较短
2.瘤胃中的微生物多为厌氧菌，某实验小组欲从牛的瘤胃中分离出能分解尿素的微生物，下图表示筛选流程，甲、乙、丙均为培养基。下列说法错误的是( )
A.培养基上加石蜡的目的是隔绝外界的氧气
B.只有乙培养基上能形成肉眼可见的菌落
C.甲和丙培养基可以增加目的菌株的浓度
D.乙培养基是以尿素为唯一碳源的鉴别培养基
3.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是( )
A. 某一稀释度下至少涂3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目少
B. 3号试管中的样品溶液稀释倍数为104倍
C. 5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个
D. 该实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基作对照，用以判断选择培养基是否有选择作用
4.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是
A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
5.在从土壤中分离出分解纤维素的微生物的实验中，先进行选择培养，再用刚果红染色法进行分离，先选择培养的目的是( )
A.浓缩目标菌种
B.除去杂菌，获得能分解纤维素的纯种菌
C.杀灭不需要的微生物
D.在微生物的菌落上获得纤维素分解菌菌种
6.下列与某实验小组分离产脲酶菌的实验设计相关的说法，不合理的是( )
A.可选择富含尿素的土壤作为样品来分离目的菌株
B.能分解酚红指示剂使其褪色的是产脲酶菌株
C.富集培养的目的是增加目的菌的浓度
D.在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源
7.微生物培养过程中，常使用选择培养基和鉴别培养基。其中鉴别培养基是在基础培养基中加入某种特殊化学物质，该物质可以与某种微生物的代谢物发生反应，产生明显的特征性变化。下列不属于鉴别培养基的是( )
选项 基础培养基中加入的特殊化学物质 出现的变化
A 青霉素 出现大菌落
B 刚果红、纤维素 出现透明圈
C 可溶性淀粉 出现淀粉水解圈
D 醋酸铅 产生黑色沉淀
注：真菌菌落一般比细菌菌落大
A.A B.B C.C D.D
8.下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法，错误的是( )
A.因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离
B.测定土壤中不同微生物的数量，选用的稀释范围不同
C.如果得到了3个或3个以上菌落数目在30~300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数
D.牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出些细菌菌落
9.垃圾分类是对垃圾收集处置传统方式的改革,是对垃圾进行有效处置的一种科学管理方法。去掉可回收的、不易降解的物质,可以减少垃圾数量达60%以上,从而减少污染。处理生活垃圾的有效方法之一是用微生物对其进行降解,下图表示筛选高效降解淀粉菌种的过程。相关叙述正确的是( )
A.乳制品厂废水中含有大量淀粉,该废水是分离高效降解淀粉菌种的首选样品
B.该实验中菌液接种到培养基上所用的接种工具只能选择火焰灼烧过的接种环
C.稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外,也常用来统计样品中活菌的数目
D.由于菌种对碘的分解能力不同,所以菌落①与菌落②产生透明圈的大小不同
10.将适量马铃薯去皮后切成小薄片，加水煮沸20min后，用纱布过滤，加入少量葡萄糖和琼脂，并用蒸馏水定容后即可制备得到马铃薯琼脂培养基。下列相关叙述错误的是( )
A.该培养基的配方中缺少氮源和无机盐
B.按物理性质划分该培养基属于固体培养基
C.该培养基所培养微生物的同化类型为异养型
D.若用该培养基培养霉菌，则需要将pH值调至酸性
参考答案
1.答案：D
解析：A、在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找，要得到分解尿素的细菌，可以在长期使用尿素肥料的农田土壤中采集土样，A正确；
B、分离能分解尿素的细菌，需要加入以尿素为唯一氮源，这种加入尿素的培养基在功能上属于选择培养基，B正确；
C、菌落是由单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见有一定形态结构的子细胞的群落，利用稀释涂布平板法纯化菌种时常用菌落数作为统计结果，C正确；
D、本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，应在使用前就做好标记，标记时要注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等，D错误。
故选D。
2.答案：D
解析：D、乙培养基是以尿素为唯一碳源的选择培养基，在该培养基上只有能分解尿素的微生物能够生存，D错误。故选D
3.答案：C
解析：A、设置重复组，增强实验的说服力与准确性，故某一稀释度下至少涂3个平板。稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，A正确；
B、据图可知，将10g土样加入到90mL无菌水中定容至100mL后，此时土样稀释倍数为10倍，再经3次10倍稀释得到3号试管中的样品，故3号试管中样品的稀释倍数是104倍，B正确；
C、5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为（168+175+167）÷3×106÷0.1≈1.7×109个，C错误；
D、要判断选择培养基是否起到选择作用，需设置接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作对照，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落种类数目多于选择培养基上的菌落类型，则说明起到了选择作用，D正确。
故选C。
4.答案：A
解析：在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，即可初步鉴定所培养的细菌是否可以分解尿素。综上所述，A项正确，B、C、D三项均错误。
5.答案：A
解析：A、在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此选择培养可以起到浓缩目标菌种的作用，A正确；
B、选择培养不能得到单一菌种，B错误；
C、该培养基中的化学成分不能杀死其它微生物，C错误；
D、选择培养时用液体培养基，微生物在培养液中繁殖，不能获得目标菌落，D错误。
故选A。
6.答案：B
解析：AD、为了筛选可分解尿素的细菌，可选择富含尿素的土壤作为样品来分离目的菌株，尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该土壤能生长，AD正确；
B、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，B错误；
C、富集培养的目的是增加目的菌的浓度，以增加目的菌种数量，C正确。
故选B。
7.答案：A
解析：A、加入青霉素的培养基可以选择出能够抗青霉素的微生物，该培养基属于选择培养基，A符合题意;
B、纤维素分解菌能够产生纤维素酶，可以把纤维素分解为纤维二糖和葡萄糖，纤维素可以与刚果红染液结合呈红色，含有纤维素分解菌因为产纤维素酶可以分解纤维素而使菌落周围出现无色的透明圈，所以加入刚果红的培养基属于鉴别培养基，B不符合题意;
C、淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖,淀粉水解后遇碘不再变蓝色，使菌落出现淀粉水解圈，该培养基属于鉴别培养基，C不符合题意;
D、某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成硫化氢，硫化氢与培养基中的醋酸铅作用而生成黑色的硫化铅沉淀，黑色沉淀越多，表示生成的硫化氢量也越多，该培养基属于鉴别培养基，D不符合题意。
8.答案：D
解析：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间适于计数的平板。土壤中不同类型的微生物的数量不同，因此在测定其数量时，选用的稀释范围也不同。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，从而说明选择培养基的筛选作用。
9.答案：C
解析：乳制品不会含有大量的淀粉，所以乳制品厂废水并不是分离高效降解淀粉菌种的首选样品，A错误;该实验中菌液接种到培养基上所用的方法应为稀释涂布平板法，接种工具为涂布器，B错误;菌落①与菌落②产生透明圈的大小不同是因为菌种对淀粉的分解能力不同，D错误。
10.答案：A
解析：马铃薯细胞中含有蛋白质和无机盐，可分别作为氮源和无机盐，A错误；该培养基加有琼脂，按物理性质分类该培养基属于固体培养基，B正确；马铃薯中含有糖类物质，糖类可作为碳源，所以该培养基所培养微生物的同化类型为异养型，C正确；培养霉菌时需将培养基的pH值调至酸性，D正确。

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