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3.1重组DNA技术的基本工具学案
【预习新知】
（一）限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
(1)来源：主要来自________。
(2)特点：具有________。
①识别双链DNA分子的某种________________。
②切割特定核苷酸序列中的________。
(3)作用：断开每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的____________。
(4)结果：产生________________。
(5)应用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的________不同，切割位点________，说明限制酶具有________。
（二）DNA连接酶—“分子缝合针”
根据DNA连接酶的来源不同，可以将它分为两类：
一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为DNA连接酶。DNA连接酶只能将 连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。
另一类是从 分离出来的，称为T4DNA连接酶。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的 ，又可以“缝合”双链DNA片段的 ，但连接 之间的效率比较低。
例、右图为DNA分子的切割和连接过程。
(1)EcoRI是一种 酶，其识别序列是 ，切割位点是
与 之间的 键。切割结果产生的DNA片段末端形式为 。
(2)不同来源DNA片段结合，在这里需要的酶应是 连接酶，此酶的作用是在 与 之间形成 键，而起“缝合”作用的。还有一种连接平末端的连接酶是
（三）基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
（1）基因操作过程中使用载体两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。
（2）现在通常使用的载体是 它是一种相对分子质量较小、独立于拟核DNA之外的环状DNA，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个。
（3）质粒通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以 复制，也可整合细菌拟核DNA中，随着拟核DNA的复制而复制。
（4）其他载体还有 和 等。
（5）作为载体必须具备以下条件：
能够在宿主细胞中复制并稳定地保存，具有多个限制酶切点，
以便与外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选，如对抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
【巩固训练】
1.下列有关重组DNA技术基本工具的叙述正确的是( )
A.DNA聚合酶是构建重组DNA分子必需的工具酶
B.不同的限制酶切割产生的黏性末端一定不同
C.相同黏性末端连接形成的DNA片段，一定会被原限制酶识别
D.质粒做为基因工程常用的载体，并不是原核细胞特有的结构
2.限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示，下列有关说法正确的是( )
A.一个DNA分子中，酶a与酶b的识别序列可能有多个
B.酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接
C.酶a与酶b切断的化学键不完全相同
D.用酶a切割有3个切割位点的环状DNA分子，得到4种切割产物
3.利用基因工程技术，将T-DNA片段插入到A基因中导致A基因突变，可获得突变体。为获知T-DNA插入位置，可用PCR技术进行扩增，应从下图选择的引物组合是 ( )
A. 引物Ⅰ与引物Ⅱ B. 引物Ⅰ与引物Ⅲ
C. 引物Ⅱ与引物Ⅳ D. 引物Ⅲ与引物Ⅳ
4.在基因工程操作中限制性内切核酸酶是不可缺少的工具。下列关于限制性内切核酸酶的叙述，错误的是( )
A.限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取
B.限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNA
C.限制性内切核酸酶的活性受温度和pH等因素的影响
D.不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端
5.回文序列是一段特定的核苷酸片段，其特点是一条核苷酸链与其互补链从5'端到3'端的碱基序列相同。短回文序列往往是限制酶的识别位点，下列叙述正确的是( )
A.回文序列中（A+T）的数目与（C+G）的数目相等
B.回文序列可能会存在于质粒中
C.限制酶作用于回文序列的氢键
D.短回文序列均由6个核苷酸组成
6.某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( )
a酶切割产物（bp） b酶再次切割产物（bp）
2100：1400：1000：500 1900：200：800：600：1000：500
A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
B.a酶与b酶切出的黏性末端相互连接后的序列仍可被a酶切割
C.a酶与b酶切割的化学键与DNA连接酶缝合的化学键不同
D.用a酶切割与线性DNA分子相同碱基序列的质粒，得到的切割产物相同
7.下列关于基因工程基本工具的叙述，正确的是( )
A.限制性内切核酸酶能够识别新冠病毒特定的核苷酸序列并在特定位点切开磷酸二酯键
B.EcoRⅠ识别序列和切割位点为G↓AATTC，则形成的黏性末端为AATTC-
C.与DNA聚合酶不同，DNA连接酶发挥作用时不需要DNA模板
D.用做分子运输车的质粒常有特殊的抗生素合成基因，便于重组DNA分子的筛选
8.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是( )
A.大多数限制酶识别的核苷酸序列由6个核糖核苷酸组成
B.不同来源的限制酶可能识别相同的序列，甚至有相同的切点
C.DNA连接酶能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸片段上
D.E·coliDNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
9.下列关于质粒的叙述，正确的是( )
A.质粒和真核细胞DNA的基本组成单位不同
B.质粒的复制过程是在受体细胞外独立进行的
C.质粒是存在于所有细胞中蛋白质合成的场所
D.质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
10.下列关于质粒的说法，错误的是( )
A.使用质粒是为了避免目的基因被分解
B.质粒只能在与目的基因重组后才能进入细胞
C.没有限制酶就无法使用质粒
D.质粒的复制和表达遵循中心法则
参考答案
1.答案：D
解析：A、限制酶和DNA连接酶是构建重组DNA分子必需的工具酶，构建重组DNA分子时不需要DNA聚合酶，A错误； B、不同的限制酶切割产生的黏性末端可能相同，B错误； C、不同的限制酶切割产生的黏性末端可能相同，由不同限制酶切割形成的相同黏性未端连接形成的DNA片段，不能被原限制酶识别，C错误； D、质粒作为基因工程常用的载体，并不是原核细胞特有的结构，部分真核细胞也有，如酵母菌，D正确。
故选：D。
2.答案：A
解析：A、一个DNA分子中，可能存在1至多个酶a与酶b的识别序列，A正确；
B、由图可知，酶a与酶b识别的序列虽然不同，但切出的黏性末端相同，相同的黏性末端能相互连接，B错误；
C、酶a与酶b切断的化学键均为相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；
D、质粒为环状DNA分子，用酶a切割有3个识别位点的质粒，可得到3种切割产物，D错误。
故选A。
3.答案：C
解析：
4.答案：B
解析：限制性内切核酸酶主要从原核生物中分离纯化而来，A正确；限制性内切核酸酶只能识别和切割DNA，不能识别和切割RNA,B错误；限制性内切核酸酶的活性受温度和pH等因素的影响，C正确；不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端，也可能切割出不同的黏性末端，D正确。
5.答案：B
解析：A、回文序列是一段特定的核苷酸片段（两条链碱基互补），回文序列中（A+C）的数目与（T+G）的数目相等，A错误；
B、短回文序列往往是限制酶的识别位点，质粒是一段环状的DNA分子，存在限制酶的识别位点，故回文序列可能会存在于质粒中，B正确；
C、限制酶作用于回文序列的磷酸二酯键，C错误。
D、短回文序列往往是限制酶的识别位点，故短回文序列可能由4、6、8个或其他数量的核苷酸组成，D错误。故选B。
6.答案：A
解析：A、由题表可得，a酶切割后形成四个片段，因此在该DNA分子中，a酶有3个识别序列，再次切割后，片段增加2个，因此b酶有2个识别序列，A正确；
B、由图可知，a酶与b酶切出的黏性末端相同，可以相互连接，但相互连接后得到的核苷酸序列中没有a酶识别序列，因此不能被 a酶识别，B错误；
C、a酶与b酶切割的化学键与DNA连接酶缝合的化学键相同，都是磷酸二酯键，C错误；
D、质粒是环状DNA分子，与线性DNA相同碱基序列的质粒含有3个a酶的切割位点，则其被a酶切割后可以得到3种切割产物，D错误。故选A。
7.答案：C
解析：A、限制性内切核酸酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使特定部位的磷酸二酯键断开，而新冠病毒是RNA病毒，遗传物质是RNA，A错误；
B、EcoRⅠ识别序列和切割位点为G↓AATTC，则形成的黏性末端为CTTAA-，B错误；
C、DNA连接酶连接DNA片段的磷酸二酯键，发挥作用不需要模板，也不需要识别特定序列，C正确；
D、载体质粒上的抗生素抗性基因通常作为对重组DNA分子鉴定和筛选的标记基因，不是抗生素合成基因，D错误。故选C。
8.答案：B
解析：A、大多数限制酶识别的核苷酸序列由6个脱氧核糖核苷酸组成的，A错误；
B、不同来源的限制酶可能是同一种限制酶，可以识别相同的识别序列，甚至有相同的切点，B正确；
C、DNA连接酶可以连接两个DNA片段，而DNA聚合酶能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸片段上，C错误；
D、E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，D错误。
故选B。
9.答案：D
解析：A、质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，组成单位与真核细胞的DNA完全相同，都是脱氧核苷酸，A错误；
B、质粒作为基因工程的载体，可以进入受体细胞进行自我复制，B错误；
C、细胞中蛋白质合成的场所是核糖体，C错误；
D、质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子，主要存在于原核细胞中，D正确。
故选D。
10.答案：B
解析：A、使用质粒是为了避免目的基因被分解，以使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达，A正确;B、质粒也能进入细胞，B错误;.C、质粒是双链环状DNA分子，没有限制酶切割目的基因就无法插入，就无法使用质粒，C正确;D、质粒的复制和表达也遵循中心法则，D正确。

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