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3.2基因工程的基本操作程序学案
【预习新知】
（一）第一步：目的基因的筛选与获取
1．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的__________。
(2)____________的构建。
(3)将目的基因导入________。
(4)目的基因的____________。
2．目的基因
(1)目的基因：用于__________等的基因。主要是指____________的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①较为有效的方法：从相关的________和________的基因中进行筛选。
②认识基因结构和功能的技术方法：________技术、________数据库、________工具。
3．获取目的基因的途径
(1)________目的基因。
(2)构建基因文库获取目的基因。
(3)________获取目的基因。
4．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR是________________的缩写。
(2)PCR原理：________________。
(3)PCR条件：一定的缓冲溶液、________、分别与两条模板链结合的________、4种脱氧核苷酸和________________酶。
(4)每次循环的过程：变性→复性→延伸。
①变性：加热至90 ℃以上时，________________。
②复性：冷却至____℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：加热至72 ℃左右时，4种脱氧核苷酸在耐高温的__________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(5)特点：上一轮循环的产物作为下一轮反应的________，每一次循环后，目的基因的量可以________，即成________形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。
(6)鉴定：常用____________来鉴定PCR的产物。
（二）第二步：基因表达载体的构建
1.操作目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够
作用。
2.基因表达载体的组成及其作用
一个基因表达载体的组成，除了 、 外，还必须有 、 等(如图所示)。
3.基因表达载体的构建过程
(1)用一定的 切割载体，使其出现一个有黏性末端(或平末端)的切口。
(2)用 种或 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)加入适量 ，使切下的目的基因片段拼接到载体的切口处。
（三）第三步：将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
（1）花粉管通道法（受体细胞：__________）
①用微量注射器将含__________的DNA溶液直接注入_____中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助__________通道进入胚囊。
（2）农杆菌转化法
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是__________。
②特点：a.能在自然条件下侵染_____植物和_____植物，而对大多数_____植物没有侵染能力。b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的_________（_______的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的__________上。
③实验思路（过程）：将目的基因插入Ti质粒的_____中，通过农杆菌的_____作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的__________上，使目的基因能够维持_____和_____。
④具体转化方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选__________，并再生成植株。b.可以将_____直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
2.将目的基因导入动物细胞——__________法
（1）受体细胞：__________。因为__________容易表现出__________。
（2）过程：构建基因表达载体并提纯→利用__________将基因表达载体注入动物的__________中→早期胚胎培养→__________→获得具有新性状的动物。
3.将目的基因导入微生物细胞——__________法
（1）受体细胞：常用__________作为受体细胞，其中以__________最广泛。优点：繁殖_____、单细胞、遗传物质__________、易于培养。
（2）__________法（__________法）的一般过程
Ca2+处理大肠杆菌（Ca2+的作用：增加_______________）→使细胞处于一种能吸收周围环境中__________的生理状态（这种细胞称为__________细胞）→将重组的_____________导入其中。
（四）第四步：目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
(1)导入水平
①技术手段： 等技术。
②检测目的：检测受体细胞的 上是否插入了 。
(2)转录水平
①技术手段： 等技术。
②检测目的：检测目的基因是否转录出了 。
(3)翻译水平
①技术手段： 技术。
②检测目的：检测目的基因是否 。
2.个体水平的鉴定
(1)鉴定方法：例如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
(2)鉴定目的：确定目的基因是否赋予了转基因生物特定的 及程度。
【巩固训练】
1.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达( )
A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B.通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C.提取受体细胞合成的相应蛋白质,利用抗原一抗体杂交技术进行检测
D.抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
2.像BclⅠ（-T↓GATCA-）、BglⅡ（-A↓GATCT-）、MboI（-↓GATC-）这样，识别序列不同，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是( )
A.不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点
B.用限制酶切割外源DNA分子中部获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有4个
C.用BclI和BglⅡ切割质粒和目的基因时，形成的重组质粒的碱基排列顺序一定相同
D.用MboI切割质粒，用BclⅠ和BglⅡ切割目的基因，形成的重组质粒可被MboI再次切开
3.为了在大肠杆菌细胞中成功表达人胰岛素基因，首先需要提取细胞的mRNA，经逆转录等过程来获取目的基因。下列相关叙述错误的是( )
A.逆转录过程需要四种游离的核糖核苷酸作为原料
B.用于逆转录的mRNA只能从胰岛B细胞中获取
C.经逆转录得到的目的基因可经过PCR技术进行扩增
D.逆转录获取目的基因时遵循碱基互补配对原则
4.天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是( )
A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA，从而获得互补DNA，再扩增基因B
B.利用DNA连接酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中可以获取基因B
C.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞
D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞
5.如图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中AmpR为抗氨苄青霉素基因）。下列叙述正确的是( )
A.可同时选用限制酶PstⅠ,SmaⅠ对含目的基因的DNA进行切割
B.过程2中，可直接将过程①得到的产物注入受体细胞
C.过程③需要用到纤维素酶和果胶酶，以便获得并培养活的原生质体
D.过程④中，若利用探针在试管苗细胞内检测到目的基因，则转基因成功
6.下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是( )
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存
C.将PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出，放在高温环境中迅速融化
D.在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
7.CRISPR/Cas13d技术是一项以向导RNA(gRNA)引导Cas13d蛋白定向作用于靶向RNA的新兴技术。研究人员设计了若干个gRNA，分别靶向新冠病毒RNA基因组的不同肽编码区，但不影响人体细胞的RNA，作用机理如图所示。下列相关叙述错误的是( )
A.gRNA通过与靶向RNA碱基互补配对将Cas13d蛋白引导至特定位点
B.Cas13d蛋白能定向切开相邻两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键
C.与限制性内切核酸酶相比，Cas13d蛋白不具有特异性识别能力
D.该技术有望成为一种能定向、灵活治疗RNA病毒感染的新方法
8.下列关于基因工程及其应用的叙述正确的是( )
A.若要生产转基因抗病水稻，可先将目的基因导入大肠杆菌中，再转入水稻细胞
B.用氨基酸序列推测合成的目的基因与原基因的编码区中的外显子一致
C.用PCR技术能检测饮用水中重金属物质的含量
D.作为运载体要有多种限制酶的切点，但对一种限制酶而言，最好只有一个切点
9.大肠杆菌pUC118质粒具有氨苄青霉素抗性基因,某限制酶唯一切点位于该质粒的lacZ基因中。在特定的选择培养基中,若lacZ基因没有被破坏,则大肠杆菌菌落呈蓝色;若lacZ基因被破坏,则菌落呈白色。如图表示转基因操作过程,下列说法错误的是( )
A.作为受体大肠杆菌应不含氨苄青霉素抗性基因,以便于筛选
B.若大肠杆菌的菌落为蓝色,则质粒未导入大肠杆菌
C.选择培养基中除必需的营养物质外,还应加入适量氨苄青霉素
D.应选择白色菌落的大肠杆菌进行扩大培养
10.下图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，其中tetr是四环素抗性基因、ampr是氨苄青霉素抗性基因。下列有关叙述正确的是( )
A.质粒P1经“酶处理”后平末端转变成黏性末端，有利于与目的基因片段的连接
B.质粒P2和目的基因片段可在DNA聚合酶或DNA连接酶的作用下形成重组质粒
C.若受体微生物能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，说明成功导入了重组质粒P3
D.E·coli DNA连接酶既可以连接平末端，又可以连接黏性末端
参考答案
1.答案：A
解析：检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。①分子水平上的检测：通过PCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原一抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定；检测生物个体是否具有抗性及抗性程度；检测基因工程产品与天然产品的活性是否相同等。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，故选A。
2.答案：C
解析：A、酶具有专一性，不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，A正确；
B、用限制酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧（两侧的两条链），因此要断裂4个磷酸二酯键，B正确；
C、切割质粒和切割目的基因用均用BclⅠ和BglⅡ，由题干可知，两种酶切割后产生的黏性末端相同，形成的重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，C错误；
D、切割质粒用MboⅠ，产生黏性末端且识别序列为-GATC-，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，产生黏性末端（-GATC-），形成的重组质粒中原来的BclⅠ和BglⅡ的切割位点的序列发生改变，不能再被这两种酶切割，但不影响MboⅠ的作用（能识别-GATC-），D正确。
故选C。
3.答案：A
解析：A、逆转录过程是以RNA为模板合成DNA的过程,需要以四种游离的脱氧核糖核苷酸为原料,A错误;B、由于基因的选择性表达,所以用于逆转录的mRNA只能从胰岛B细胞中获取,B正确;C、经逆转录得到的目的基因可经过PCR技术进行扩增,获得大量的目的基因,C正确;D、逆转录获取目的基因时遵循碱基互补配对原则,即A一T、U—A、G—C、C一G,D正确。故选:A。
4.答案：A
解析：控制蓝色色素合成的基因B即为我们所需要的目的基因，可通过逆转录法获得基因B，再进行扩增以增加其数量；基因文库中保存的是各基因片段，提取时使用限制性核酸内切酶；为使目的基因在受体细胞中稳定存在且能向下一代遗传，应先在体外使用DNA连接酶构建基因表达载体，然后再导入玫瑰细胞。
5.答案：A
解析：目的基因两侧分别有限制酶SmaⅠ和PstⅠ的识别序列，且质粒上也含有这两种限制酶的切割位点，所以可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA进行切割，A正确;目的基因不可直接导入植物细胞，常用花粉管通道法或农杆菌转化法，B错误;过程③为植物组织培养，不需要用纤维素酶和果胶酶处理，C错误；过程④中，若利用探针在试管苗细胞内检测到目的基因，不能说明转基因成功，转基因成功的标志是目的基因成功表达出相应性状，D错误。
6.答案：C
解析：为了避免外源DNA等因素的影响，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌，A正确；PCR所用的缓冲液和酶一般需要分装成小份，并在-20 ℃储存，使用前，将PCR所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化，B正确，C错误；为避免试剂的交叉污染，在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，D正确。
7.答案：B
解析：向导RNA(gRNA)通过与靶向RNA碱基互补配对，引导Cas13d蛋白定向作用于靶向RNA，切开相邻两个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，A正确，B错误；限制酶通过识别特定的碱基序列起作用，Cas13d蛋白无特异性识别碱基序列的能力，C正确；向导RNA(gRNA)可定向作用于靶向RNA，可用于治疗RNA病毒感染，D正确。
8.答案：D
解析：A、水稻属于单子叶植物，一般利用基因枪法将目的基因导入受体细胞，A错误；
B、由于密码子的简并性，用氨基酸序列推测合成的目的基因与原基因的编码区中的外显子不一定相同，B错误；
C、PCR技术的原理是DNA半保留复制，重金属物质不含DNA，因此用PCR技术不能检测饮用水中重金属物质的含量，C错误；
D、对某种限制酶而言，运载体最好只有一个限制酶切点，但运载体上还要有其他多种限制酶切点，D正确。
故选D。
9.答案：B
解析：A. 判断重组质粒是否导入，依据质粒上的氨苄青霉素抗性基因（标记基因），所以受体细胞应不含有氨苄青霉素抗性基因，A正确；
B. 若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色，因此如果大肠杆菌的菌落为蓝色，说明lacZ基因没有被破坏，因此pUC118质粒已转入受体菌，但目的基因没有接入运载体，B错误；
C. 选择培养基中除必需的营养物质外，还应加入适量氨苄青霉素，这样可以将没有导入目的基因的大肠杆菌淘汰，C正确；
D. 白色菌落的大肠杆菌是转入了目的基因的，所以应选择白色菌落的大肠杆菌进行扩大培养，D正确。
故选：B。
10.答案：A
解析：A、质粒P1经“酶处理”后由平末端转变成黏性末端,能提高目的基因片段和质粒的连接效率,A正确;B、质粒P2和目的基因片段可在DNA连接酶的作用下形成重组质粒,这里不需要DNA聚合酶,B错误;C、图示的质粒均含有抗氨苄青霉素的基因,因此,若受体微生物能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,则不能说明成功导入了重组质粒P3,C错误;D、用PCR鉴定筛选出的菌落中是否含正确插入目的基因的重组质粒,应选择引物乙和丙即可,因为PCR扩增的DNA片段是引物之间的序列,扩增乙和丙之间的序列就包含了目的基因,因而没有必要扩增更长的序列,D错误;故选A。

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