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复习回顾
练习．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是（ ）A．大多数动物细胞在体外培养时表现为单层贴壁生长
B．进行细胞培养时，通常采用培养皿或封闭的培养瓶放置在CO2培养箱中进行培养C．培养骨髓瘤细胞时，为防止接触抑制现象，需进行分瓶培养过程
D．传代培养时，细胞都需要用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，再用离心法收集后分瓶培养
松盖
一种癌细胞
悬浮生长类不用
练习：如图为iPS细胞的获得及用其培育不同种细胞的示意图（c Myc、Klf4、Sox2和Oct3/4等基因与细胞的脱分化有关）。回答下列问题：
(2)在培养iPS细胞的过程中，需要为培养细胞提供无菌、无毒的环境，为达到此目的对培养液采取的具体操作有 （答两点）。②类似于植物组织培养中的 过程。(3)过程③④为iPS细胞提供的条件不同，分化得到的细胞不同，本质上是
的结果。(4)iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞的原因 。
（1）对成纤维细胞进行培养时，常用胰蛋白酶处理使之分散成单个细胞，这说明细胞间的物质为 ， （填“能”或“不能”）用胃蛋白酶处理成纤维细胞，原因是 。
脱分化
pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中变性失活
灭菌、无菌操作、定期更换培养液和加一定量的抗生素
多数动物细胞培养的适宜
基因选择性表达
无须破坏胚胎，避免免疫排斥反应
新冠疫情迅速扩张初期，利用康复者恢复期血浆治疗重症和危重症患者是一个非常有效的一个重要手段，但这种疗法难以大规模应用。
不同浆细胞（B淋巴细胞）
血清抗体：产量低、纯度低，特异性差p49
筛选单个浆细胞（B淋巴细胞）
只产生一种特异性抗体
细胞群
大量增殖
量产
哪种细胞是可以无限增殖？
癌细胞
有什么方法能使细胞同时具备：产生抗体+无限增殖能力？
动物细胞融合
2.2.2
动物细胞融合与单克隆抗体
1.概念：
动物细胞融合技术，就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
2.原理：
细胞膜具有一定的流动性
一、动物细胞融合技术
成功标志？
细胞核的融合
3. 诱导方法：
物理法：
化学法：
生物法：
灭活病毒诱导法
电融合法
PEG融合法
与植物原生质体融合的方法相同
——动物细胞融合特有
P49旁栏：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
原理
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚→细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布→细胞膜打开，细胞发生融合。
灭活：用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构
课本 p51 一、1
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、
植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、
灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较
二、单克隆抗体
米尔斯坦和柯勒发明，并获得了诺贝尔生理学或医学奖。
一个B淋巴细胞（浆细胞）
只分泌一种特异性抗体
骨髓瘤细胞
（癌细胞）能无限增殖
动物细胞融合
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞
单一的
使细胞同时具备：
产生抗体+无限增殖能力。
复制
阅读课本P49-50，了解单克隆抗体的制备过程
1.如何获得能产生特定抗体的B淋巴细胞？
2.细胞之间一定会发生融合吗？如果发生融合（仅考虑2个细胞之间），有多少种情况？ 得到的杂交瘤细胞都能产生特定抗体吗？
3. 整个过程至少进行几次筛选？筛选的目的分别是什么？能想到筛选的思路吗？
4.如何获得单克隆抗体？
二、单克隆抗体
注射特定的抗原
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
动物细胞融合
一段时间后
从脾中提取
多种
小鼠曾接受多种抗原刺激
1.未融合的亲本细胞
2.融合的细胞
①杂交瘤细胞
②B-B细胞
③瘤-瘤细胞
多种
（一）单克隆抗体的制备过程
筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞
具有同种核的细胞
杂交瘤细胞
足够数量的能产生所需抗体的特定杂交瘤细胞
第一轮筛选：用特定的选择培养基
第二轮筛选：克隆化培养、抗体检测
①注射到小鼠腹腔内
②体外培养
获取单克隆抗体
从小鼠腹水中
从细胞培养液中
动物细胞培养
（一）单克隆抗体的制备过程
1.未融合的亲本细胞
2.融合的细胞
①特定的杂交瘤细胞
②B-B细胞
③瘤-瘤细胞
能准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合；可以大量制备。p50背
第二课时
完成 p51 一、1
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
C
（1）第一次筛选的目的
__________________________
（2）如何筛选
____________________________
（3）筛选原理
____________________________
____________________________
____________________________
筛选获得杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
复习：单克隆抗体的制备过程
立即提取B细胞？
特点？
（5）第二次筛选的目的
____________________________
____________________________
（6）如何筛选
____________________________
____________________________
____________________________
（7）选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞
（8）抗体检测原理
__________________________________
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
阳
抗原和抗体能特异性结合(分子水平的鉴定）
（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞
____________________________
____________________________
（10）如何获取单克隆抗体
①体外培养
____________________________
②小鼠腹腔内培养
____________________________
（11）单克隆抗体的优点
_______________________________
_______________________________
在体外条件下大规模培养（接种于 培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备（背）
【拓展】第一代鼠源抗体（利用小鼠杂交瘤细胞生成的抗体）能够被人体免疫系统识别，引起人抗鼠抗体反应，使得单抗药物疗效减弱，并且引起严重的不良反应，因此第一代单抗药物的临床应用受到极大的限制。
（二）单克隆抗体的应用
（二）单克隆抗体的应用
1、诊断试剂
2、运载药物
1、用作诊断试剂
原理：
抗原与抗体能特异性结合
优势：
特异性强、灵敏度高、
可大量制备（标准化生产）
新冠病毒抗原检测试剂盒
（二）单克隆抗体的应用
诊断疾病、鉴别病原体
女性怀孕后会分泌一种糖蛋白,-人绒毛膜促性腺激素(HCG)，尿液中会检出HCG的存在。用抗HCG单克隆抗体制备的试纸可以测试女性是否怀孕。(抗原-抗体杂交法)
肿瘤、心血管畸形的定位诊断
同位素标记的单克隆抗体
荧光标记的单克隆抗体
成像
在特定组织
2、用于运载药物
（二）单克隆抗体的应用
抗体：靶向运输作用
药物：杀伤靶细胞（治疗效应）
讨论1 抗体和药物各具有什么作用？
单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
讨论3：ADC在临床上有哪些优势？
协同发挥
抗体特异性识别的作用+
细胞毒素的杀伤作用
→靶点清楚、毒副作用小
主要用于癌症治疗
讨论2 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可作为ADC偶联的药物？
①用放射性同位素标记的单克隆抗体进行靶向放疗
②用作用于细胞信号转导通路的药物，阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长。
结合同位素的单抗
利用单抗将放射性核素导入肿瘤细胞 , 对肿瘤细胞进行特异性的杀灭作用, 同时最大限度地降低放射性核素对机体的损伤作用, 从而大大增强了杀伤肿瘤细胞的效率
3、用于治疗疾病
（二）单克隆抗体的应用
课后习题2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
补充练习：新冠病毒可以采用试纸进行抗原检测。抗原检测一般采用双抗体夹心法，其原理如图所示。结合垫处含有足量的、可移动的、与胶体金（显红色）结合的抗体1（能识别待测抗原某一部位），T处固定有抗体2（能识别待测抗原另一部位），C处固定有抗体3（抗-抗体1），能与抗体1结合。当抗体2或抗体3与对应的物质结合后，能将其截留。若待测样本中含新冠病毒，则显色结果为T线和C线处均显红色，判断为阳性。
思考：显色结果为 ，判断为阴性？
只有C线处显红色
评小本P17 1D、P19 4C
晚练6A、8、9B、10（3）、11（3）
补充：根据资料设计一种实验方案，筛选杂交瘤细胞
资料：①体外培养的动物细胞在增殖过程中需进行DNA的复制。B淋巴细胞的DNA合成有两条途径：D途径和S途径，其中D途径可被氨基喋呤（A）阻断。
D途径可以在普通培养液中进行。S途径需在普通培养液中加入次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）两种成分才能进行。
实验所用的骨髓瘤细胞缺少S途径所需的酶，只能通过D途径合成DNA
②无增殖能力的细胞在培养液中仅存活5-7天
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
DNA
DNA
DNA
D途径、S途径
D途径
D途径、S途径
无增殖能力
无限增殖
无限增殖
补充：根据资料设计一种实验方案，筛选出杂交瘤细胞
BB
B
瘤瘤
瘤
杂交瘤细胞
如何在含有多种细胞的培养液中筛选出杂交瘤细胞？
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
DNA
DNA
DNA
D途径、S途径
D途径
D途径、S途径
无增殖能力
无限增殖
无限增殖
在培养液中加入氨基喋呤（A）
、次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）
培养基（HAT）
选择
1
3
2
资料5：将杂交瘤细胞悬液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞。
（1）若杂交瘤细胞悬液的密度为1000个/ml，操作者预计在96孔板中每孔加入0.1ml稀释后的细胞悬液，为保证每孔最多只有一个细胞，原杂交瘤细胞悬液至少应该稀释_________倍；
100
筛选能分泌狂犬病毒抗体的杂交瘤细胞
稀释
筛选能分泌狂犬病毒抗体的杂交瘤细胞
2、若每孔最多只有一个细胞，如何鉴别出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞？
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
侧面模拟图
★ 阳性
取上清液进行抗体检测
★
抗体检测板
培养
克隆化
单克隆
阳性
单克隆抗体

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