资源简介

(共37张PPT)
3.1 重组DNA技术的基本工具
第3章 基因工程
1944年艾弗里证明了遗传物质是DNA。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1970年，发现了第一个限制性核酸内切酶。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物批准上市。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1967年，科学家发现，质粒有自我复制能力，可以转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1973年，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR。
基因工程发展历程
History of genetic engineering
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因重组
②操作水平：
③操作结果：
①操作原理：
DNA分子水平
定向地改造生物遗传性状，获得人们所需的生物类型和生物产品
基因工程
环状病毒侵染的番木瓜
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
载体
——“分子运输车”
限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
DNA连接酶
——“分子缝合针”
基本工具：
1.来源：
2.功能：
3.作用的化学键：
磷酸二酯键
一
“分子手术刀”——
限制性内切核酸酶
（简称限制酶）
主要从 中分离纯化出来，目前分离出数千种。
识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，使特定部位的
磷酸二酯键断开。
磷酸二酯键
原核生物
注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。
（专一性）
EcoRⅠ：
专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间的磷酸二酯键断开。
几种常见的限制酶的识别序列及切割位点：
①大多数限制酶的识别序列由 个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
②限制酶的名字的由来 P72
6
EcoRⅠ
BamHⅠ
TaqⅠ
Hind Ⅲ
EcoRⅠ
种加词头两个字母
菌株型号
数字表示分离出来的第几种限制酶
属名首字母
大肠杆菌R型菌株分离出来的第一种限制酶
限制酶所识别的序列有什么特点？
限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线(如图)，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
能被限制性酶特异性识别的序列一般都是回文序列：即正反读顺序相同，围绕一条轴线对称排列。
读：5’→ 3’
【反馈练习】
下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
一
“分子手术刀”——
限制性内切核酸酶
（简称限制酶）
4.切割结果：
EcoR Ⅰ
中轴线
粘性末端
平末端
Sam Ⅰ
产生黏性末端或平末端
【问题探究1】请写出下列限制酶切割形成的黏性末端。
黏性末端？
…CTAG
…TTAA
…TCGA
…CTAG
【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
【问题探究2】选择限制酶的注意事项
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 和 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
如图甲可选择 。
如图甲不能选择 。
PstⅠ
SmaⅠ
PstⅠ
EcoRⅠ
【问题探究3】为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
拓展思维：
1.要想从一个DNA分子中获得某个特定的基因需要有几个酶切位点？
产生几个末端？
2
4
CT TCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGAT T
GGCATCTTAA
AAT TCCGTAG
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
使用EcoRⅠ酶剪切目的基因
识别序列GAATTC
在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性核酸内切酶切割，会产生4个末端。
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
A A T T C
G
G
C T T A A
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
拓展思维：2.把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办？
“分子缝合针”——
2.分类：
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
1.作用:
类型 来源 作用 相同点 差别
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复
磷酸二酯键
只能连接黏性末端
既能连接黏性末端
又能连接平末端(效率较低)
二
DNA连接酶
重组DNA
DNA连接酶
★思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
回顾：DNA聚合酶的作用
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
1.作用：
将目的基因送入受体细胞
2.最常用的载体——
质粒
质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
质粒
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
★思考：质粒为什么适合作为载体？作为载体需要具备那些条件？
质粒
3.载体需具备的条件
—供外源DNA片段（目的基因）插入其中
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
——便于重组DNA分子的筛选
——鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
标记基因的作用
导
思考：
噬菌体或某些动植物病毒作为载体，其原理是 。
病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
物种（组织）特异
若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别
4.种类：
质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒
重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
1.“分子手术刀”——
1）来源：
2）作用：
3）作用结果：
2.“分子缝合线”——
1）作用：
2）分类：
3.“分子运输车”——
1）作用：
2）种类：
3）应具备条件：
限制酶
产生黏性末端、平末端
DNA连接酶
将不同的DNA片段连接起来
磷酸二酯键
将外源基因送入受体细胞
质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）
主要从原核生物中分离纯化出来。
载体
识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位：
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
——便于重组DNA分子的筛选
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
小结：基因工程的基本工具
【探究 实践】DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理
1.粗提取DNA的原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
①在酒精溶液中的溶解性：
②在NaCl溶液中的溶解性：
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
2.鉴定DNA的原理
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
二、材料用具
1.选材：
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入
试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
2.去除杂质——
3.DNA的析出——
4.DNA的鉴定——
1.破碎细胞——
对照组：如何设置？
洋葱
研磨液
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
二苯胺
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min
三、方法步骤
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；
或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
2mol/L的NaCl
DNA的粗提取与鉴定
实践·探究
（1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
（3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合.
含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
思考与讨论：
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶，以下说法正确的是 ( )
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特基因的DNA探针
A
【课堂检测】
3.图1为某种质粒结构简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是( )
A.在基因工程中若只用一种限制酶
完成对质粒和外源DNA的切割，则可
选EcoRⅠ
B.如果将一个外源DNA分子和一个
质粒分别用 EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中 EcoRⅠ酶切点有1个
C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理
D.质粒是一种结构很小的、能自主复制的环状DNA，是基因工程中最常用的载体
B
4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置（插入点有a、b、c）示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ 　 ）
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a B．①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b
A
5.图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ四种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依a次由____________________________连接。
(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是______末端，其产物长度为______________________________。
脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖
平
537 bp、790 bp、661 bp
MspⅠ BamHⅠ MboⅠ SmaⅠ
C↓CGG G↓GATCC ↓GATC CCC↓GGG
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有____种不同长度的DNA片段。
4
MspⅠ BamHⅠ MboⅠ SmaⅠ
C↓CGG G↓GATCC ↓GATC CCC↓GGG

展开更多......

收起↑