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(共22张PPT)
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；
2.检测内容及方法:
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
病原体接种实验等
1.目的:
目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测与鉴定
基因是否插入染色体DNA（存在）
方法1：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳操作
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
(1)首先取出转基因生物的基因组DNA；
(2)将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记，以此做探针；
(3)使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中。
基因探针:简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂），且顺序已知的，与目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。
目的基因的检测与鉴定
基因是否插入染色体DNA（存在）
方法2：DNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
基因是否插入染色体DNA（存在）
原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
方法2：DNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
基因是否转录（mRNA）
转基因生物
PCR操作
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
提取RNA
转基因生物
标记的基因探针
方法1：PCR扩增
方法2：RNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
基因是否翻译（蛋白质）
抗原-抗体杂交技术
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
脱分化
(Western Blot)流程图
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
检测蛋白质:
抗原和抗体杂交
四、第四步：目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测与鉴定
转基因生物 检测方法 观察指标
抗虫植物 害虫吞食 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的 转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能
活性正常
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
目的基因的检测与鉴定
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR、核酸分子杂交技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
检测内容及方法
（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入到某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入到四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
双抗性实验——个体水平
重组体的筛选方法
（2）受体细胞可能有：
①含目的基因的细菌——无抗性
②含目的基因—目的基因的细菌——无抗性
③含质粒的细菌——有氨苄青霉素和四环素抗性
④含质粒—质粒的细菌——有氨苄青霉素和四环素抗性
⑤含重组质粒的细菌——有氨苄青霉素抗性
双抗性实验——个体水平
重组体的筛选方法
（3）筛选方法：
①将转化后的细菌放在含氨苄青霉素培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌、含质粒的细菌和含质粒—质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落；
②再利用灭菌的绒布影印到含四环素培养基上，不生长的即为含目的基因的菌落，如图1、5。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
双抗性实验——个体水平
重组体的筛选方法
双抗性实验——个体水平
重组体的筛选方法
例1.(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌,结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:
双抗性实验——个体水平
重组体的筛选方法
(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件
有　　　　。而作为基因表达载体,除满足上述基本
条件外,还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述
四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因
的细胞是不能区分的,其原因是 ;并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)的细胞也是不能区分的,其原因是 。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有 的固体培养基。
二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长；
二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长；四环素
利用特定表型：蓝白斑筛选——个体水平
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法
大肠杆菌的质粒上含有lacZ基因，其编码的产物β－半乳糖苷酶在X－gal和IPTG同时存在时，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。如图为利用该质粒进行的转基因过程，请据图判断菌落①②③的颜色分别是（ )
A.蓝色 白色 白色
B.蓝色 蓝色 白色
C.蓝色 白色 蓝色
D.白色 蓝色 白色
利用特定表型：蓝白斑筛选——个体水平
重组体的筛选方法
利用特定表型：蓝白斑筛选——个体水平
双酶切法——分子水平
重组体的筛选方法
载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图1所示。用XhoI和SalI分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是 。
PCR法——分子水平
重组体的筛选方法
(2019·江苏高考·节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是　　　　　　　　　　　　。
某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒
中扩增出了400 bp片段,原因是 　。
乙丙
目的基因反向连接
PCR法——分子水平
重组体的筛选方法
(2019·天津高考·节选)
B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达,但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如下实验。
PCR法——分子水平
重组体的筛选方法
获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的是　(多选)。
A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
BCD
小结
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。

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