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(共32张PPT)
PCR扩增技术
学习目标
基础目标：运用结构与功能观等观念理解PCR技术的原理和过程（生命观念）；
拓展目标：能结合PCR技术的原理和过程分析在目的基因扩增中存在的特殊情况、操作以及非特异性产物出现原因（科学思维）；
挑战目标：通过PCR技术的原理，举一反三，理解融合PCR、PCR定点突变技术等操作方法（科学思维）。
教学重难点
理解PCR技术的原理和过程
PCR是 的缩写，它是一项根据 的原理，在体外提供 的各种组分与反应条件，对目的基因的 进行大量复制的技术。
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
参与DNA复制
核苷酸序列
①原理：
②操作环境：
③目的：
④优点：
DNA半保留复制
体外复制（PCR扩增仪 / PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
模拟体内DNA复制过程
PCR扩增技术
DNA体内复制的条件
PCR扩增技术
PCR技术所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
体外用高温代替解旋酶 打开DNA双链
2条DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链
2种引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始
连接脱氧核苷酸
一定的缓冲液（Mg2＋） 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要
Mg2＋激活
通过控制温度使DNA复制在体外反复进行
PCR扩增技术
PCR扩增技术
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。
在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
引物是从模板链的 端与之结合的。
①引物是什么？
引物是单链还是双链 是短DNA链还是短RNA链
引物结合到DNA模板链的 端还是 端
PCR扩增技术
【例2】(2020·新高考Ⅰ)通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是_________________________________________。
引物能与WX基因的cDNA特异性结合
【例3】(2022·山东)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增基因。用于扩增基因的引物需满足的条件是____________________。
两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能，引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。
②PCR技术为什么需要引物？
PCR扩增技术
PCR扩增技术
③PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？
目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。
【例4】图1为X蛋白的部分基因序列,所示序列为引物结合的部分,
据图分析:扩增X蛋白基因所需的引物序列是：_____________________。
引物1：ATGCCGTAAGTCCTAC
引物2：TGATCTACGGCTTACA
PCR扩增技术
【例6】(2017·江苏)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（见图），请分别说明理由。
(1)引物Ⅰ与引物Ⅱ局部互补配对而失效
(2)引物Ⅰ′自身折叠后互补配对而失效
④PCR技术扩增目的基因前需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？
两条引物之间不能互补配对。
PCR扩增技术
【例7】(2020·北京)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白HMA3基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A.①+③ B.①+② C.③+② D.③+④
B
3’
5’
3’
5’
①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。
PCR的过程
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
注意：不需要解旋酶
PCR扩增技术
3’
5’
3’
5’
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
注意：引物结合在模板链 端，引导子链从 方向复制。
3'
5'端→3'端
PCR扩增技术
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
注意：复性和延伸都是从子链 方向进行。
5'端→3'端
PCR扩增技术
PCR扩增技术
【例11】PCR技术可用于基因工程四个步骤中的 以及目的基因的检测、鉴定。设定PCR反应程序时，往往先进行94℃下5min的预变性处理，目的是确保 。正式进行PCR时，复性时温度要降到55℃，目的是 。
目的基因的获取
DNA分子充分变性，形成单链
使引物与DNA模板链结合
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
第一轮循环的产物
第二轮循环的产物
PCR扩增技术
PCR的结果
①由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成 形式扩增。
指数
2n
②经过n次扩增循环后，目的基因数为 ，需要引物数量为 。
2n+1-2
PCR扩增技术
PCR扩增技术
PCR的结果
PCR扩增技术
PCR技术的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数
含引物的DNA分子数
含一种引物的DNA分子数
含两种引物的DNA分子数
含等长的DNA分子数
2
2
3
2
4
4
8
8
1
0
7
6
2n
2n
2n-1
2n-2
PCR扩增技术
思考：利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？
第三次循环
3’
5’
目的基因
5’
3’
PCR扩增技术
第
一
次
循
环
90℃以上，DNA双链解开
50℃左右，引物与DNA结合
72℃左右，新DNA合成
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
PCR扩增技术
第
二次
循
环
5’
3’
5’
5’
3’
5’
高温变性、低温复性
PCR扩增技术
中温延伸
第
二次
循
环
3’
5’
PCR扩增技术
第
三次
循
环
3’
5’
目的基因
目的基因
PCR扩增技术
PCR扩增技术
【例8】用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增,设计了引物Ⅰ、Ⅱ,其连接部位如图6所示,X为某限制酶识别序列且X是引物Ⅱ上的一部分。扩增后得到的绝大部分DNA片段是（ ）
D
PCR扩增技术
【例9】已知引物1及引物2之间的序列为目的序列,若引物与DNA的结合位点如图所示,在第____轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。
2
PCR扩增技术
(2021·全国)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号）。
(2)操作③中使用的酶是_________________，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是____________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与__________特异性结合。
(4)PCR（多聚酶链式反应）技术是指____________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
(1) ④②③① (2) 耐高温的DNA聚合酶 延伸 (3) 病原菌DNA
(4) 在生物体外大量快速扩增DNA片段的技术
比较项目 体内DNA复制 PCR反应
解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶
引物 一小段RNA 一般是单链DNA分子片段
合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的 端开始延伸，都是连续合成的
PCR扩增技术
过程 边解旋，边复制 变性→复性→延伸
循环次数 受生物体自身控制 一般30次
产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段
相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则
PCR扩增技术
课后作业：
1、复习作业：依托课前练，整理本节课重难点及相关题型，完善笔记；
2、练习作业：完成3.2.1课后作业；
3、预习作业：依托下节课课前练熟悉PCR扩增产物的鉴定方法等相关知识点，勾画重难点。
DNA片段的扩增及凝胶电泳
PCR仪
DNA分子电泳
DNA片段的扩增及凝胶电泳
实验原理
1.DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
1987年的PCR仪
可变温的PCR仪
PCR扩增DNA片段还利用了_____________________的原理；
DNA半保留复制
DNA片段的扩增及凝胶电泳
2、DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
DNA片段的扩增及凝胶电泳
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
DNA片段的扩增及凝胶电泳
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？

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