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(共34张PPT)
1.2（二） 微生物的选择培养和计数
一、筛选菌株
1. 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。
思考：为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。
能否在实验室条件分离出某种菌？
人为提供有利于目的菌株生长的条件（营养、温度、pH等），同时又抑制或阻止其他微生物生长的培养基。 （P16）
选择培养基
加入青霉素的培养基
不加氮源的无氮培养基
不加含碳有机物的无碳培养基
——分离出固氮菌
——分离出自养型微生物
如果想分离土壤中分解尿素的细菌，应该怎样设计实验呢？
几种常见选择培养基的设计思路
——分离酵母菌、霉菌等真菌
（青霉素能杀死细菌、放线菌）
（1）加入某种化学物质
（2）营养缺陷
使用将pH调至酸性的培养基
——分离出耐酸微生物
（3）培养条件
P6: 思考-讨论
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3和CO2,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
尿素的立体结构
1、如何设计培养基配方，将土壤中分解尿素的细菌分离出来？
2、该培养基与普通（完全）培养基有哪些共同点和不同点？
以尿素作为唯一氮源
（其他微生物由于缺乏脲酶，不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长）
——选择培养基
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
配方一：培养细菌（p10）
配方二：培养可以分解尿素的细菌
普通（完全）培养基 选择培养基
1、从物理性质看，上述培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？
固体培养基
配方一是：普通培养基；配方二是：选择培养基
2、此培养基中共有哪些成分？哪些作为碳源和氮源？
碳源、氮源、水、无机盐
碳源
氮源
碳源
氮源
思考：可否直接制备土壤溶液，接种到该选择培养基上进行培养？
【资料1】：通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。
【资料2】：右图是用平板划线法接种的培养结果。
不行，（分解尿素的）细菌数量太多，难以计数
不能
稀释
思考：
1.可否直接制备土壤溶液，接种到选择培养基上进行培养？
2.平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？
①平板划线不能确定取样的多少；
②最初划线处生长出来的菌落聚集在一起无法计数；
③灼烧接种环时死亡的菌体数无法估计。
稀释涂布平板法
——将菌液进行一系列的 ，再将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基 的进行培养。
——在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成 ，从而能在培养基表面形成 。
梯度稀释
表面
单个细胞
单菌落
（1）原理：
★稀释涂布平板法
（2）实验操作：
系列稀释
涂布平板
二
稀释涂布平板法操作过程
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
①铲取土样，将样品装入纸袋中（举例表层3-8cm）
②将10g土样加入90ml无菌水的锥形瓶中，
10倍
稀释了几倍？
取1mL上清液加入9mL无菌水，依次等比稀释。
到第六支试管时,共稀释了几倍？
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
10g
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
微量移液枪
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
微量移液枪
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
微量移液枪
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
恒温培养箱
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
10g
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
微量移液枪
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30 37 ℃的恒温培养箱中培养1 2 d。
稀释涂布平板法操作过程
恒温培养箱
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
10g
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
微量移液枪
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30 37 ℃的恒温培养箱中培养1 2 d。
稀释涂布平板法操作过程
为了保证“无菌”，涂布平板的所有操作都应在 进行。
火焰旁
分离出来后如何计数呢？
（2）显微镜直接计数法：
二、微生物的数量测定
（1）稀释涂布平板法:
统计活菌
统计活菌数和死菌数的总和
原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
阅读课本P18，思考：
1、统计菌落数目除了稀释涂布平板法外，还有哪些方法？
2、两种方法统计的结果是否相同？
1、统计方法：
（1）稀释涂布平板法
培养基上表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的的 ，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。
①原理：
②计数原则：
一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。
（减小实验的偶然误差）
一个活菌
③结果：
统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。
少
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
☆平板划线法和稀释涂布平板法的比较
既能用于分离微生物，
也能统计样品中活菌的数目
只能用于分离微生物，不能计数
平板划线法
稀释涂布平板法
练《小本》p6：5
5.某同学在稀释倍数为1×106的培养基中测得平板上的菌落数的平均值为275,那么每克样品中的菌数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL) (　　)
A.2.75×108个 B.2.75×109个
C.275个 D.27.5个
B
计算大本p17：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
P19：典例剖析下图为土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验中样品稀释示意图。据图分析,下列叙述错误的是(　　)
A.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管中的10倍
B.5号试管中稀释液进行平板培养的结果表明每克该土壤中的菌株数目为 1.7×106个
C.当样品稀释度足够高时,一般平板上一个单菌落来源于一个活菌
D.某一稀释度下至少涂布3个平板,该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目少
B
p18探究.实践
提出问题
①如何分离土壤中能分解尿素的细菌？
②如何计算每克土壤样品中有多少分解尿素的细菌？
利用尿素作为唯一氮源的选择培养基
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
提供无机盐
提供碳源
提供氮源
提供水分
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
实验设计
1.土壤取样
①要求：富含有机质、酸碱度接近中性的潮湿土壤
（取样时一般要铲去表层土）
②取样土层：绝大多数分布在距地表3~8cm的土壤层
2.配置培养基
以尿素为唯一氮源的选择培养基
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
4.涂布平板
Q1：测定土壤中细菌的数量，一般稀释倍数要比测定真菌_____（高/低）。
Q2：当第一次做实验的时候，要把稀释范围弄_____（宽/窄）
3.样品的稀释
高
宽
（涂布到选择培养基上）
较多
（以保证选出菌落数在30-300的平板）
5.培养观察
将平板倒置于30~37℃下培养1~2d，每隔24h观察统计一次。
防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
（选菌落数目稳定时再计数）
结果分析与评价
结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及
选择培养基是否筛选出一些菌落？
设置未接种的培养基，做空白对照
看有无菌落生长：若空白对照的培养皿没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
接种在牛肉膏蛋白胨的完全培养基上
看菌落数：若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落明显多于选择培养基的菌落数，说明培养基筛选出了一些尿素分解菌。
(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
制备以纤维素为唯一碳源的选择培养基
地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨,其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用,使人们能够利用秸秆等生产酒精,用纤维素酶处理服装面料等。
P20二、拓展应用 2
(2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌 为什么
可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
(3)有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
刚果红
纤维素
红色复合物
纤维素酶
红色消失， 出现透明圈
红色复合物
透明圈
纤维素分解菌
判断依据：
刚果红染色法
出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
如何判断细菌分解纤维素的能力大小？
纤维素分解菌筛选的方法和原理
纤维素分解菌
看透明圈的大小
资料：酚红指示剂是一种常用的酸碱指示剂，在PH为6.6—8.0时显示橙色，PH低于6.6显示黄色，PH高于8.4呈现红色。分解尿素的细菌能产生脲酶，脲酶将尿素分解成了氨，培养基PH升高，可使酚红指示剂变红。
脲酶阴性
脲酶阳性
进一步探究
思考：结合所给资料，说出如何对分离的菌种进行鉴定？
在以尿素为唯一氮源的选择培养基中加入酚红指示剂。
鉴别培养基
是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。
到生活中去
测定饮水中大肠杆菌数量的方法：
鉴别培养基
04
课后习题
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
(1)这种培养基是一种选择培养基。（ ）
(2)利用这种石油降解菌可以降解石油,修复土壤。（ ）
(3)相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A.菌落中的细菌数目是固定的
B.平板上的一个菌落就是一个细菌数目相同
C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际
D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
筛选出可以降解化合物A的微生物
显著降低
选择
扩增
细菌计数板计数
S形增长
目的菌能否在自然环境中大量生长繁殖、是否会产生对环境有害的代谢物、降解化合物A后是否会产生二次污染等问题
可行。这是基因工程的基本思路。
扩增
筛选高效
纯化
纯化
不同意。提示：只检测一个冰激凌数据太少，不能排除偶然因素的影响。
②没有必要。提示根据国家的标准，自来水中的大肠杆菌数目应该是非常少的。即使冰激凌中大肠杆菌数目超标了，也不可能很离谱，如果进行梯度稀释，最后培养出来的菌落数可能不在计数要求的范围内，从而导致结果误差大。
③需要设置对照组。一组不进行涂布或者用无菌水涂布平板；另一组涂布大肠杆菌。前者可以说明培养基是否被污染，后者可以说明该培养基能否培养出大肠杆菌。
B
（3）说明冰激凌中不仅有大肠杆菌，还有其他细菌或真菌等。
统计结果比实际值偏少。因为有些菌落可能会重叠，统计时容易将其误认为是一个菌落，并且这种计数方法统计的是活菌的数目。
（4）应该马上去小店告知店主这批冰激凌不能再卖了；还要告知食品卫生管理部门，以对这批冰激凌的来源进行追踪调查。
04
课后习题
3.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官—瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。瘤胃中的微生物多为厌氧微生物，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
小结
讨论1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落？
对照的培养皿没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
接种后的牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落明显多于选择培养基的菌落数，说明培养基筛选出了一些尿素分解菌。
讨论2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
如果得到了两个或多个菌落数为30~300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
讨论3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异大，可能是什么原因引起的？
如果用同一土样进行操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。

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