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(共45张PPT)
第2节 微生物的培养技术及应用
本节聚焦
什么是培养基？如何配制？
什么是无菌技术？
怎样进行酵母菌的纯培养？
向经过杀菌处理的牛奶中添加对人体有益的乳酸菌，再经过发酵就可以制成酸奶，在家里自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。
怎样才能保证无处不在的 杂菌 不混入发酵物中呢？
从社会中来
讨论：
（微生物）
难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括 及一些 等。
本章提及的微生物主要指用于发酵的 。
微生物概述
（P9右下角相关信息）
细菌、真菌、病毒
原生生物
细菌和真菌
实验室培养微生物有什么要求呢？
微生物的纯培养
无菌技术
培养基的配制
一方面要为人们需要的微生物提供 ；另一方面要确保 ，并将需要的 。
实验室培养微生物有什么要求呢？
合适的营养和环境条件
其他微生物无法混入
微生物分离出来
研究和应用微生物的前提
（发酵工程的重要基础）
——防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物
实验室培养微生物有什么要求呢？
实验室培养微生物
确保其它微生物无法混入
分离需要的微生物
提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
微生物的纯培养
无菌技术
培养基的配制
Part 1
培养基的配置
Medium configuration
【自主探究】请结合教材P9-10，思考这些问题。
1.什么是培养基？
2.培养基的用途有哪些？
3.培养基的种类有哪些？
4.培养基的必备营养成分有哪些？
5.配制培养基时，如何满足不同微生物的特殊需求？举例说明。
1.概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其_________的营养基质。
2.作用：用以 微生物或 。
3.类型：
固体培养基
营养物质
生长繁殖
培养、分离、鉴定、保存
积累其代谢物
课本P9
液体培养基
按物理性质：
液体培养基、固体培养基（半固体培养基）
微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落
（扩大培养、工业生产）
（分离、计数、鉴定等）
加入凝固剂(如琼脂)
是一种从红藻中提取的多糖。在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常规培养条件下呈固态。
注意：凝固剂（如琼脂），不能给微生物提供能量，只起到凝固作用。
菌落
1.定义：
2.特征：
不同菌落的形状、大小、颜色、光泽度、透明度等不同。
3.功能：
菌落是鉴定菌种的重要依据。
[知识补充]
单个或少数同种菌体在固体培养基表面或内部大量繁殖，形成肉眼可见的子细胞群体。
放线菌
念珠菌
霉菌
酵母菌
培养基的配制
化学 成分来源
划分 培养基种类 特点 用途
功能用途划分
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
分类、鉴定
天然培养基
合成培养基
用已知成分的化学物质配制
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
培养基中加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂，用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
鉴别培养基
培养基的配制
耐高浓度食盐的金黄色葡萄球菌
伊红-美蓝培养基
鉴别大肠杆菌
（出现带金属光泽的深紫色菌落）
水、碳源、氮源和无机盐
① 碳源
常见的有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
② 氮源
常见的氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
③ 无机盐：
4.配方：
（1）基本成分：
调节酸碱平衡（PH）、维持渗透压
NaCl、 K2HPO4、MgSO4等
培养自养型微生物
不加含碳有机物的培养基
培养固氮微生物
不加氮源的培养基
应用最广泛普通的细菌基础培养基
1.根据培养基的物理性质，该培养基属于哪类培养基？
2.为什么培养基需要氮源 （P10旁栏思考）
3.培养任何微生物，是否必须有有机碳源和有机氮源？
培养基的营养构成
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 、 磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 和维生素等
琼脂 20g ；
NaCl 5g ；
H2O 定容至1000ml 。
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成
是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
固体培养基
例：自养型微生物可利用无机碳源（如空气中的CO2）；
固氮微生物可利用无机氮源（如空气中的N2）。
不一定
碳源、氮源、水、无机盐
碳源、氮源
碳源、氮源
凝固剂
无机盐
水
思考：
2.碳源都可以提供能量？
含C、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能量。
1.同一种物质能否既做作碳源又做氮源？
CO2是自养微生物的碳源，但不提供能量。
3.无机氮源NH3能提供能量吗？
可以提供能量。
硝化细菌：
NH3----HNO2-----HNO3 （释放化学能）。
（2）特殊需求：培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ；
②培养霉菌时，需要将培养基调至 ；
③培养细菌时，需要将培养基调至 ；
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
4.培养基的营养构成：
主要指生长因子：维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
思考：所有微生物是否都可以用培养基进行培养
提示:否。病毒是没有细胞结构的微生物,必须在活细胞内寄生并以复制的方式增殖,因此不能用培养基进行培养。
生长因子：通常是指微生物自身不能合成或合成量不足，但又是微生物生长和代谢所必需的小分子。
（2023·广东）研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线（如图）和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是（ ）
A．a点时取样、尿素氮源培养基
B．b点时取样、角蛋白氮源培养基
C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D．c点时取样、角蛋白氮源培养基
D
Part 2
无菌技术
Aseptic technique
【自主探究】请结合教材P10-11，思考下列问题：
1.获得纯净的微生物培养物的关键是什么？
2.消毒和灭菌的区别是什么？
3.消毒和灭菌常用的方法有哪些？它们适用于哪些对象？
4.为了防止杂菌污染，具体措施有哪些？（实验前和操作时）
——防止杂菌污染
无菌技术
无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括：
消毒
灭菌
获得纯净的微生物培养物的关键是：
防止杂菌污染。
无菌技术
类型 理化因素作用强度 消灭微生物数量 芽孢和孢子能否被消灭
消毒
灭菌
较为温和
强烈
部分微生物
全部微生物
一般不能
能
1. 比较消毒和灭菌对微生物作用效果的差异
2.无菌操作的对象是什么？
培养皿
接种环
培养基
操作的空间、操作者的衣着和手等
【芽孢】有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
【孢子】细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
拓展
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min
或80 ～90 ℃煮30S～1 min
化学药剂消毒法
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、
用氯气消毒水源
紫外线消毒法
房间、仪器设备
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需保持干燥的物品,如玻璃器皿、金属用具等
物品放入干热灭菌箱,
160～170 ℃加热2～3 h
湿热灭菌
（高压蒸汽灭菌）
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
消毒与灭菌的比较
无菌技术
1. 牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是什么？
在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
2 .为什么体积分数为70%～75%的酒精杀菌效果最好？
若酒精浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；若酒精浓度过低，杀菌能力减弱。
想一想
4.防止杂菌污染的措施：
P10旁栏思考2：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
有效避免操作者被微生物感染。
实验前：
对操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒
对所用器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
操作时：
避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触造成污染
在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行
二、无菌技术
不耐高温的液体（牛奶）
接种室、超净工作台
培养皿.吸管等玻璃器皿耐高温、需保持干燥的物品
接种环等金属工具
实验操作者的双手
培养基
家庭餐具等生活用品消毒
a.煮沸消毒法
b.巴氏消毒法
c.化学药剂消毒
d.紫外线消毒
e.灼烧灭菌
f.干热灭菌
g.高压蒸汽灭菌
巩固练习：将以下器具、物品或对象与所采用的消毒或灭菌方法连线
Part 3
微生物的纯培养
Pure culture
任务2：请同学们自主阅读教材P11-13，完成以下问题：
1.相关概念：培养物？纯培养物？纯培养？（P11）
2.什么是菌落？单菌落？（P12）
3.获得单菌落的方法？（P12）
4.酵母菌的纯培养的基本步骤？（注意倒平板和接种的具体操作）
二、微生物的纯培养
配制培养基
灭菌
接种和分离酵母菌
培养酵母菌
倒平板
稀释涂布平板法、平板划线法
制备培养基
微生物群
在固体培养基上
分散或稀释
单个微生物
繁殖
单菌落
获得单菌落的方法？
稀释涂布平板法
平板划线法
纯培养物
稀释涂布平板法
平板划线法
微生物的纯培养
培养物
纯培养物
纯培养
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成含特定种类微生物的群体。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
获得纯培养物的过程就是纯培养。
平板划线法、稀释涂布平板法
1. 原理：
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
2. 获得单菌落的方法：
1.菌落：
2.单菌落：
3.特征：不同种菌落的 、 、
、 、 等不同。
4.作用：作为 的重要依据。
什么是菌落、单菌落？
酵母菌菌落
菌种鉴定
大小
形态
光泽度
颜色
透明度
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
制备培养基
①配制培养基
②灭菌
③倒平板
培养基：高压蒸汽灭菌
培养皿：干热灭菌
温度：50℃左右
冷凝后倒置
操作：酒精灯火焰附近
思考：如果要调节培养基的pH，应该在灭菌前还是灭菌后？
灭菌前
（一）制备培养基
1.配制培养基：
2.灭菌：
3.倒平板：
对培养基和培养皿进行灭菌
50℃，酒精灯火焰附近
三、酵母菌的纯培养
马铃薯琼脂培养基（固体培养基）
如果要调节培养基的pH，应该在灭菌前还是灭菌后？
灭菌前
倒平板的具体步骤：
酵母菌的纯培养
探究-实践
1.拔出锥形瓶的棉塞
2.将瓶口迅速通过火焰
3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10-20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖
4.等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
不能完全打开，以免杂菌污染培养基。
目的：可以防止冷凝水落入培养基，造成污染。
目的是灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
1.培养基灭菌后，为什么需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板
＞50℃，烫手。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落产生以确定是否被污染。
3.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
2.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
因为平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,平板倒置后,可防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染。
问题讨论:
＜50℃，若不及时操作，琼脂就会凝固
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板还能用来培养微生物吗？
不能，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
平板划线法
(可用于计数)
接种和分离
制备培养基
①配制培养基
②灭菌
③倒平板
培养基：高压蒸汽灭菌
培养皿：干热灭菌
温度：50℃左右
冷凝后倒置
操作：酒精灯火焰附近
稀释涂布平板法
如果要调节培养基的pH，应该在灭菌前还是灭菌后？
灭菌前
平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑥将皿盖打开一条缝隙，将接种环在培养基表面迅速划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
③试管口通过火焰
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。最后一次划线不与第一次划线相连
杀死接种环上原有微生物。
以免接种环温度太高，杀死菌种。
杀死上次划线后残留菌种，
使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端
杀死接种环上残留的菌种，
避免污染环境和感染操作者。
思考：接种结束后还要灼烧接种环吗？
线条末端的菌体数量少，每次从末端划线，使菌体的数目随着划线次数的增加而减少，最终分散成单个细胞，繁殖得到单菌落。
因为最后一次划线已经将菌种稀释成单个细胞，如果与第一次划线相连，就增加了菌体的数量，难得到单菌落。
微生物的纯培养
接种和分离酵母菌
1
2
3
4
5
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上残留菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞。
杀死接种环上原有微生物
合作探究
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,还需要灼烧接种环吗？为什么？
2.在灼烧接种环之后，要等其冷却再进行划线，目的是什么？
避免接种环温度过高而杀死菌种。
3.除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
4.为什么划线时要注意不能划破培养基？
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
平板划线法
将接种后的平板倒置，放入恒温培养箱中培养一段时间。
(可用于计数)
接种和分离
制备培养基
培养
①配制培养基
②灭菌
③倒平板
培养基：高压蒸汽灭菌
培养皿：干热灭菌
温度：50℃左右
冷凝后倒置
操作：酒精灯火焰附近
稀释涂布平板法
培养
对照
将一个未接种的平板倒置，放入相同环境中培养相同时间。
如果要调节培养基的pH，应该在灭菌前还是灭菌后？
灭菌前
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。
检验培养基灭菌是否彻底
（三）培养酵母菌
三、酵母菌的纯培养
成果分析与评价
2.正常情况下，培养基上能观察到几种形态的菌落？
如果有不同形态的菌落，分析原因？
一种；
无菌操作不规范或菌种不纯。
(1)在未接种的培养基表面是否有菌落生长 如果有,说明了什么
5.实验结果分析与评价
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基灭菌不彻底或被杂菌污染。
可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
(2)在接种酵母菌的培养基上,你是否观察到了单菌落 这些菌落的颜色、形状和大小是否一致 如果你观察到了不同形态的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的吗
(3)你是如何记录实验结果的 请与其他同学交流、互评。
请评估这一论点是否可信。
课外拓展
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水，密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。
请评估这一论点是否可信。
想一想
评估论点的可信程度
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
P14【思维训练】评估论点的可信程度
一、概念检测
1.判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
①干制：降低食品的含水量；
②腌制：食盐、糖等制造高渗环境，抑制微生物的生长和繁殖；
③低温储存：降低微生物的代谢速率从而抑制微生物的生长和繁殖。
P14 练习与应用
二、拓展应用
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请回答：
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有________________。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于哪一步操作？
（3）洗手后我们就能进行无菌操作了吗？
操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
培养皿和培养基
接种
洗手后手上还有一些微生物
通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
P14 练习与应用
2. 将野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如图。请分析：
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。
二、拓展应用
P14 练习与应用

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