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第2节
微生物的培养技术及应用
1、培养物：
2、纯培养物、纯培养：
相关概念：
微生物的纯培养
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
二
酵母菌的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
不同菌落的形状、大小、颜色等不同。菌落是鉴定菌种的重要依据。
二
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。
稀释涂布平板法
平板划线法
酵母菌的纯培养
二
酵母菌的纯培养
一、目的要求
1.学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。
2.学会进行无菌操作。
3.尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
二、材料用具
酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸(或报纸)、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。
三、实验步骤
1.制备培养基
2.接种和分离酵母菌
3.培养酵母菌
①配制培养基
②灭菌
③倒平板
1、制备培养基（倒平板操作）
①培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板，为什么？你用什么办法来估计培养基的温度？
②倒平板时为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
③为什么倒平板时，将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能完全打开？
④在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
⑤培养基冷凝后，为什么要将培养皿倒置？
思考 讨论
阅读教材第12-13页相关内容，思考讨论下面问题：
2、接种和分离酵母菌（平板划线法接种操作）
①为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
②在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
③在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
3、培养酵母菌
①怎么确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？
②未接种的培养基直接培养起什么作用？
（1）配制培养基
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
1、制备培养基
实验步骤：
（2）灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。
培养基：
培养皿：
用高压蒸汽灭菌锅（湿热灭菌）
在干热灭菌箱内（干热灭菌）
（3）倒平板
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
①拔出锥形瓶的棉塞。
②将瓶口迅速通过火焰。
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
倒平板的具体操作步骤：
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置。
实验注意事项、分析、思考：
①培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板，为什么？你用什么办法来估计培养基的温度？
②倒平板时为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
③为什么倒平板时，将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能完全打开？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
防止杂菌污染培养基。
高于50℃则会烫手，低于50℃时若不及时操作，琼脂会凝固。
④在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
⑤培养基冷凝后，为什么要将培养皿倒置？
不能。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（1）原理：
2、接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散或稀释
生长繁殖
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线
（2）“平板划线法”实验操作
灼烧接种环
蘸取菌液
第1区接种
灼烧接种环
第2区接种
灼烧接种环
第3区接种
第5区接种
1
2
3
4
5
平板划线法注意事项：
思考：若完成图示操作，共做了五次划线，接种环灼烧灭菌了几次？
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
①为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞。
杀死接种环上原有微生物。
实验注意事项、分析、思考：
②在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
③在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
平板划线法接种操作：
划线
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；
②每次划线前接种环进行灭菌；
③每次划线都是从上一次划线的末端开始划线；
④最后一次划线不能与第一次划线相连。
平板划线法注意事项：
3、培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24～48h。
①怎么确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？
②未接种的培养基直接培养起什么作用？
将未接种的空白培养基放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长。如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
做空白对照，若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。
实验注意事项、分析、思考：
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
酵母菌的纯培养
2.接种和分离酵母菌
1.制备培养基
3.培养酵母菌
①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水）
②灭菌
③倒平板
培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅）
培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅）
用接种环在固体培养基上用平板划线法接种
平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养
【课堂小结】

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