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第二节
微生物的培养技术及应用——
微生物的选择培养和计数
第三课时
PCR技术是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
去哪里找这种酶呢？
问题探讨
黄石公园内拥有超过10000个间歇泉、泥水泉、蒸汽喷口和温泉，平均温度超过了62摄氏度，个别地方则完全是沸水，一旦不小心掉到这里面，会导致最严重的三度烧伤，一旦失足落水常常因为热而酸的泉水而尸骨全无。
因为热泉温度太高，淘汰了绝大多数微生物，只有Taq细菌被筛选出来。这种菌叫水生栖热菌，它体内有耐高温的Taq酶。
启示：寻找目的菌种时要……
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
问题探讨
人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
关键
选择培养基
微生物学中，允许　　　　　　的微生物生长，同时抑制或阻止　　　　　　微生物生长的培养基。
特定种类
其他种类
关键
筛选原理
选择培养基
（1）概念：
方法 条件 分离得到的菌种
改变培养条件
添加某种化学物质
特殊碳、氮源
营养缺陷
厌氧微生物或者兼性厌氧微生物
水生栖热菌
酵母菌、霉菌等真菌
金黄色葡萄球菌
能消除石油污染的微生物
自养微生物
固氮菌
（2）方法：
70～80℃的高温
青霉素
高浓度食盐
石油是唯一碳源
不加碳源
不加氮源
无氧环境下培养
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
去哪里找尿素分解菌呢 ？
我们发现尿素是重要氮肥，但研究发现植物并不能利用尿素。
推测：土壤中部分细菌能利用尿素分解成氨，氨被植物利用。
微生物的选择培养
要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群！
仅仅通过平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
尿素分解菌
1. 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
培养基中除了含有细菌必需的碳源、水、无机盐外，还要含有唯一的氮源——尿素。
氮源使用尿素，普通培养基一般使用蛋白胨等。
都有微生物生长所需碳源、氮源、水、无机盐。
关键
共同点
关键
不同点
微生物的选择培养
土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行_________________，然后再将菌液_______到制备好的________________上。
稀释涂布平板法
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
关键
方法
充分稀释
涂布
选择培养基
关键
原理
主要过程
梯度稀释和涂布平板
微生物的选择培养
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究实践
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌，该选择培养基的配方如下。
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4 7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
提供无机盐
提供碳源
提供氮源
提供水
可判断为固体培养基
实验原理:
（1）土壤取样
取样地点要求：
实验过程:
铁铲和取样袋在使用前都要灭菌；事毕洗手。
取样过程：
铲去表土（一般3cm左右）
注意事项：
酸碱度接近中性的潮湿土壤
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
实验过程:
（2）配制培养基
选择培养基 *以尿素为唯一氮源
思考:如何证明一个选择培养基具有选择作用呢？
应该设置完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基)作为对照，若完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
第1步：取样并稀释10倍
1×10
90mL无菌水
10g
2
铲取土样，将样品装入纸袋中。
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。
1
（3）样品的稀释与涂布平板---稀释涂布平板法
第2步：梯度稀释
1×10
90mL无菌水
3
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
107
1×
1×
1×
1×
1×
1×
106
105
104
103
102
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
第3步：涂布平板
4
取0.1mL菌液，
滴加到培养基表面
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
7
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
6
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
5
选
择
培
养
基
牛肉膏蛋白胨培养基
空白对照
涂布平板
图中的1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；
另外，还要有两个对照：
①未涂布（未接种)的选择培养基
②未涂布的牛肉膏蛋白胨培养基；
与接种的选择培养基形成对照
与接种的牛肉膏蛋白胨培养基形成对照
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
*细菌一般在30-37℃的温度下,恒温培养箱中培养1-2d（平板倒置）
②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取数目稳定时的记录作为结果。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
恒温培养箱
细菌一般选用
104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
*防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
稀释104倍
稀释105倍
稀释106倍
稀释107倍
2、所有稀释倍数的培养基，都能观察和分离出单菌落吗？
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
内容 现象 结论
有无杂菌污染的判断 空白对照的培养基中无菌落生长
空白对照的培养基中有菌落生长
菌落形态多样，菌落数偏高
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目多于选择培养基上的数目
样品的稀释 操作 得到2个或2个以上菌落数目在30~300的平板
重复组的结果 未被杂菌污染
被杂菌污染
混入其他氮源
选择培养基具有筛选作用
操作成功
若选取同一种土样，统计结果应相近
【结果分析与评价】
注意事项:
1.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
2.各操作细节要保证“无菌”。如移液管要经过灭菌，梯度稀释时，试管口和移液管在离火焰1~2cm处，涂布器要经过灼烧灭菌等。
3.本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
4.本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
本活动只是初步筛选分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
方法：在培养基中加入酚红指示剂
呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。
——鉴别培养基
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。
进一步探究
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
如何对培养基中的菌落进行科学计数呢？
平板划线法可以计数吗？
平板划线法
稀释涂布平板法
微生物数量的测定
稀释涂布平板法计数。
微生物数量的测定
计数原理
当样品的___________足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的____________。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
稀释度
一个活菌
统计的菌落往往比活菌的实际数目偏 。
低
计数结果
分析 原因
因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
微生物数量的测定
计算方法
每克样品中的菌落数=（C÷V）×M
稀释倍数
涂布平板时所用的稀释液的体积(mL）
某一稀释度下平板上生长的平均菌落数目
C ：
V ：
M ：
微生物数量的测定
例：某同学做此实验在稀释倍数105 获得3个平板，菌落数分别是85、90、95，涂布平板时均使用0.1ml菌液，计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
解：
× 105 = 9×107（个）
每克土壤中可以分离尿素的细菌数目为 9×107 个。
注意事项
① 选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落
数为30～300、适于计数的平板。
② 在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，求出平均值。
显微镜直接计数法
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数。
统计的一般是活菌数和死菌数的总和。
操作
结果
两种计数板的比较
细菌 计数板 血细胞
计数板
计数原理 厚度
适用对象
在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
较薄 (计数室深0.02mm)
较厚(计数室深0.1mm)
常用于细菌等较小的细胞
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等
测定方法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法
计数数据
优点
缺点
计算结果
计算公式
菌体本身
培养基上的菌落数
计算方便、操作简单
计数的是活菌
死菌活菌都计算在内
当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
比实际的小
比实际的大
每克样品中的菌株数
＝(C÷V )×M
每mL含菌量＝每小格平均菌体数×400×104×稀释倍数
微生物的选择培养
主要方法 稀释涂布平板法 平板划线法
主要步骤 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种环在固体培养基表面连续划线
接种工具 涂布器 接种环
菌体获取 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
能否用于计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 不能计数
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以观察菌落特征。 比较稀释涂布平板法和平板划线法
一、概念检测
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）
3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
实战演练
一、概念检测
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是( )
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
实战演练
实战演练
二、拓展应用
1. 反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
实战演练
二、拓展应用
2. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌,请你给出详细的实验方案。
实战演练
土壤取样
选择培养
梯度稀释
样品涂布到鉴别培养基
挑选菌落
实战演练
2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
实战演练
小结：几种常用的鉴别培养基
名称 主要用途 主要化学物质 特征性变化
伊红-亚甲蓝琼脂培养基 鉴别大肠杆菌 伊红、亚甲蓝 出现金属光泽的深紫色菌落
刚果红培养基 鉴别纤维素分解菌 刚果红、纤维素 纤维素被分解后出现透明圈
油脂培养基 鉴别产脂肪酶菌株 食用油、吐温、中性红指示剂 由淡红色变成深红色
淀粉培养基 鉴别产淀粉酶菌株 可溶性淀粉 淀粉被分解后出现淀粉水解圈
H2S试验培养基 鉴别产H2S菌株 醋酸铅 产生黑色沉淀
课后小结
鉴别培养基
伊红-亚甲蓝琼脂培养基
淀粉培养基
尿路菌群显色培养基
念珠菌群显色培养基

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