资源简介

(共41张PPT)
抗虫棉花
PCR体外扩增仪
电泳结果图
显微注射技术
3.2.1 基因工程的基本操作程序
学习目标
1.结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序（科学思维）。
2.针对人类生产和生活的某一需求，选取适当的基因工程技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案（科学探究）。
3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物（科学探究）。
学习重难点
教学重点：
基因工程基本操作程序的四个步骤；
DNA片段的扩增及电泳鉴定。
教学难点：
利用PCR获取和扩增目的基因；
DNA片段的扩增及电泳鉴定。
从社会中来
《一切成果都是为国分忧为民解难》节选
郭三堆
　　20世纪90年代初，我国棉铃虫连年大暴发，导致整个国家出现“棉荒”，纺织业几乎崩溃。此刻，美国孟山都公司已于1991年研制出Bt抗虫棉，我国相关部门与孟山都几经谈判，都因为对方条件苛刻，终至谈判破裂。为了我国农业的发展和安全，为了不受制于人，我们必须有自主知识产权的抗虫棉。
1991年，国家“863”计划正式启动了棉花抗虫基因工程育种研究，中国作为植棉大国无抗虫棉的历史从这一刻开始被改写。经过不懈努力，单价基因抗虫棉、双价基因抗虫棉、三系杂交抗虫棉相继研发成功。这些成果，不仅打破了美国的垄断，保护了民族利益，而且为我国农业高新技术在国际竞争中争得了一席之地。
2014年5月14日《农民日报》
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
从社会中来
培育转基因抗虫棉主要需要4个步骤：
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因的筛选与获取
转基因
抗虫棉
PART
01
目的基因的筛选与获取
● 目的基因
● 目的基因的筛选
● 目的基因的获取
目的基因
什么是目的基因？
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或
获得预期表达产物等的基因，主要指编码蛋白质的基因。
概念
实例
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）杀死棉铃虫。科学家将该细菌的杀虫基因转入棉花中，从而使棉花也能产生Bt抗虫蛋白，抵抗虫害。
编码Bt抗虫蛋白的Bt基因就是目的基因。
筛选合适的目的基因
苏云金杆菌制成的生物杀虫剂已广泛使用多年；
研究表明苏云金杆菌杀虫与Bt基因有关；
科学家对Bt基因和Bt基因表达的蛋白有较深了解。
为什么要进行目的基因的筛选与获取？如何筛选？
结合基因工程概念，有了目的基因我们才能赋予一种生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的生物类型或产品。
筛选方法
从已知结构和功能清晰的基因中进行筛选较为有效。
应用实例
筛选合适的目的基因
Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此Bt抗虫蛋白对人畜不会产生不良影响。
苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年。
Bt抗虫蛋白对人和其他动物是否有害？
在基因工程操作前应充分考虑目的基因的安全性等问题！
目的基因的获取
获取目的基因的方法有多种。
逆转录法：以目的基因转录成的mRNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。
方法一：人工合成目的基因
人工合成法：根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
第一步
第二步
第三步
第四步
根据已知的部分核苷酸序列扩增并进行标记
将基因文库中所有菌落DNA与标记的片段杂交
找出杂交呈阳性斑点，对应相应的细菌
从对应的细菌中提取目的基因
目的基因的获取
方法二：基因文库法
根据基因的部分核苷酸序列获取目的基因的为例：
目的基因的获取
1.从生物组织中提取DNA（见第一节中DNA的粗提取）；
方法三：从生物组织中直接获取
2.对提取的DNA进行纯化；
3.根据目的基因序列设计引物，利用PCR技术扩增目的基因。
PCR技术是一种在DNA聚合酶作用下体外大量扩增特异DNA片段的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。
PART
02
利用PCR获取和扩增目的基因
● pcr技术所需的条件
● pcr反应过程示意图
● pcr扩增&dna复制
PCR技术
聚合酶链式反应，缩写PCR。
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
名称
概念
回顾学习过的DNA复制的相关知识，思考PCR反应需要的条件有哪些？
DNA模板、解旋酶、DNA聚合酶、4种脱氧
核苷酸等。
PCR所需的条件
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶（体外用高温代替）
打开DNA双链
DNA母链
提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
DNA聚合酶
催化合成DNA子链
引物
使DNA聚合酶从3’端开始连接脱氧核苷酸
真核细胞和细菌DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，长度一般是20~30个核苷酸。
PCR反应过程
第一步：目的基因DNA双链受热变性后解为单链；
变性
当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链；
变性温度一般设置在90~95℃；
变性温度的设置与GC含量有关，一般GC含量越高所需的变性温度越高。
DNA受热变性断裂的是什么化学键？
氢键
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
PCR反应过程
第二步：引物与单链相应的互补序列结合；
复性
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
复性温度：50℃左右；
方向：引物只能连在2条链的3’端；
原因：DNA聚合酶只能从引物3’端连接单个脱氧核苷酸分子。
PCR反应过程
第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下将4种脱氧核苷酸加到引物3’端；
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
第四步：延伸得到的产物又可以作为下一次循环的模板，依次进行变性→复性→延伸，产生第二轮循环的产物，重复循环多次。
思考 讨论
1.PCR过程中为什么需要引物？
引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。自然界中生物DNA复制和人工PCR之所以需要引物，是因为DNA聚合酶不能从起点直接连接单个脱氧核苷酸，只能从已有的一段单链的3’端连接脱氧核苷酸。
2.PCR可以扩增mRNA吗？
不能，需要把mRNA逆转录成cDNA再进行扩增。
思考 讨论
3.在利用PCR获取和扩增目的基因时，经过N轮循环，会获得多少个DNA分子，需要多少个引物？
经过第1次循环，1个DNA分子→2个DNA分子；
除了模板2条链外，每个DNA分子上有2条引物，N次循环一共
2N个DNA分子，需要引物2 2N-2，即2N+1-2。
经过第2次循环，2个DNA分子→22个DNA分子；
经过第3次循环，4个DNA分子→23个DNA分子；
经过第N次循环，2N-1个DNA分子→2N个DNA分子。
思考 讨论
4.在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才能产生完整的目的基因？
第1次循环：
第2次循环：
第3次循环：
出现了完整的目的基因
pcr技术 & dna复制
比较项目 PCR技术 DNA复制
相同点 不同点
pcr技术 & dna复制
比较项目 PCR技术 DNA复制
相同点 模板 都需要DNA链作为模板 原料 都需要4种脱氧核苷酸； 都需要引物使DNA聚合酶从3’端开始连接脱氧核苷酸 不同点 解旋方式 高温变性解旋 解旋酶催化
场所 细胞外 细胞内
酶 耐高温DNA聚合酶 DNA聚合酶、解旋酶等
作用结果 需要控制温度变化，温度较高 细胞内温和条件
用途 短时间形成大量DNA片段 形成整个DNA分子
PART
03
基因表达载体的构建
● 基因表达载体的组成要件
● 基因表达载体的构建过程
基因表达载体的构建
能否将获得的目的基因直接导入受体细胞？为什么？
不能，因为单独的DNA片段——目的基因是不能稳定遗传的。构建基因的表达载体使为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并能够稳定遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
这就需要构建基因表达载体，这一步是培育转基因抗虫棉的核心工作。
构建基因表达载体是基因工程的核心步骤！
基因表达载体的组成要件
是目的基因与载体结合形成的重组DNA分子。
目的基因：人们所需要的基因
组成要件
概念
启动子
有时候为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制基因的表达。
位置：目的基因上游
功能：
RNA聚合酶识别和结合的位点
驱动基因的转录
终止子
位置：目的基因下游
功能：终止转录
标记基因：用于目的基因的检测与筛选
场所
体外进行
基因表达载体的构建过程
1. 用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；
2. 用相同的限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；
基因表达载体的构建过程
3. 利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样形成了一个重组DNA分子。
+
DNA连接酶
用同一种限制酶切割后获得的目的基因与载体混合，并用DNA连接酶处理后，会出现几种结果？
4种，分别是载体与载体连接、目的基因与目的基因连接、载体与目的基因结合形成的重组DNA分子（正向连接和反向连接2种）。
PART
04
将目的基因导入受体细胞
● 花粉管通道法
● 农杆菌转化法
● 其他生物导入方法
将目的基因导入受体细胞
（一）花粉管通道法
导入植物细胞
方法1： 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
子房
方法2： 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
将目的基因导入受体细胞
（二）农杆菌转化法
转化：指目的基因就进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
双子叶植物和裸子植物
适用对象:
方法1： 将新鲜叶片上取下圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
方法2：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后在培养植株并获得种子，再进行筛选鉴定等。
操作过程:
将目的基因导入受体细胞
原理:
农杆菌是一种侵染植物的微生物，其细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据这种特点，可以将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞。
农杆菌转化法原理示意图
将目的基因导入受体细胞
显微注射法
导入动物细胞
方法： 用微量注射器将目的基因导入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成具有新性状的动物。
方法： 用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组的基因表达载体导入其中。
导入微生物细胞
Ca2+处理法
受体细胞： （常用）原核生物
原理： CaCl2可以使原核生物细胞膜的通透性增大，目的基因进入细胞的机率大大增加。
PART
05
目的基因的检测与鉴定
● 分子水平检测
● 个体水平检测
● 基因工程的评估
目的基因的检测与鉴定
目的基因进入受体细胞后，是否能稳定维持和表达遗传特性，需要进行检测与鉴定，这是检查转基因抗虫棉是否培育成功的一步。
（一）分子水平检测
1. 通过PCR技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因；
2. 通过PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA；
mRNA
逆转录酶
cDNA
DNA聚合酶
DNA
PCR扩增检测
3.检测目的基因是否表达出蛋白质：提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交反应。
目的基因的检测与鉴定
（二）个体水平检测
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否具有抗性及抗性程度，基因工程产品需要与天然产品活性进行比较。
转基因抗虫棉
普通棉
基因工程的基本操作程序
通过本节课的学习，请尝试设计一套具体可行的转基因抗虫棉设计方案。
第一步：目的基因的筛选与获取
提取苏云金杆菌的DNA，根据Bt基因的序列设计引物，对Bt基因进行PCR扩增获取；
第二步：构建基因表达载体
1.用限制酶切割Bt基因与农杆菌Ti质粒产生相同的黏性末端；
2.用DNA连接酶将Bt基因与Ti质粒连接形成基因表达载体；
基因工程的基本操作程序
通过本节课的学习，请尝试设计一套具体可行的转基因抗虫棉设计方案。
第三步：农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞（棉株细胞）
1.用Ca2+处理农杆菌细胞，将构建好基因表达载体导入农杆菌；
2.筛选成功导入基因表达载体的农杆菌；
3.用导入成功的农杆菌感染棉株细胞；
4.将棉株细胞进行植物组织培养，获得完整植株。
第四步：目的基因的检测与鉴定
用普通棉花和抗虫棉花的叶片饲喂棉铃虫，观察对比效果。
基因工程评估与发展
2018年11月26日，南方科技大学副教授贺建奎在第二届国际人类基因组编辑峰会召开前一天宣布,一对名为露露和娜娜的基因编辑婴儿本月在中国健康出生。这对双胞胎的一个基因经过修改，使他们出生后能够天然抵抗艾滋病。
消息一出便震惊社会，引发了科学界的同声斥责以及对科学伦理与研究安全性的担忧。
安全？
伦理？
社会公平？
对待基因工程：应严格规范操作流程，科学客观评估风险！
课堂小结
目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选：从已知结构与功能清晰的基因中筛选
目的基因的获取：基因文库法、PCR技术、生物组织获取
将目的基因导入受体细胞
植物：花粉管通道法、农杆菌转化法；
动物：显微注射法；微生物：Ca2+处理法
PCR技术所需条件
PCR技术的操作过程
基因表达载体的构建
构建基因表达载体的过程
基因表达载体的组成要件
目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测与鉴定
个体水平的检测与鉴定

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