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大题05 生物技术与工程
【高考真题分布】
考点 考向 高考考题分布
生物技术与工程 发酵工程综合考查； 细胞工程与基因工程综合考查； 基因工程与生物技术的安全性与伦理性 2023山东卷 2023湖南卷 2023辽宁卷 2023北京卷 2023天津卷 2023重庆卷 2023浙江卷 2023湖北卷 2023海南卷 2023河北卷 2022全国卷 2022湖南卷 2022福建卷 2022广东
【题型解读】
一、现代生物科技专题部分包括发酵工程、细胞工程和基因工程三大部分，是每年高考必考的内容。通过近3年试题分析发现，应用微生物的分离纯化技术以及基因工程、细胞工程和胚胎工程相结合的技术，可以解决很多社会关注度高的生产、生活、健康方面的热点问题。这使得生物技术与工程在赢得普通大众关注的同时，也赢得了高考命题专家的青睐，成为当下热门的高频考点。
二、生物科技专题题目呈现方式也多种多样，有坐标曲线，有图表，还有流程图及文字介绍。这些新情境类题目一般具有很高的陌生度，特别是山东卷等大量的专业术语和未知的新技术、新流程的出现，往往让考生不知所措。生物技术主要考察传统发酵技术和微生物培养两部分。传统发酵技术与生产生活实际联系密切，题目一般以生活、学习和实践作为学科情景来考察考生分析解决问题的能力。微生物培养对知识要点和操作的要求更高，题目难度也相应大一些。题目一般以科学实验和探究作为学科情境，考察考生的逻辑推理能力和实验探究能力。生物技术与工程方面的考题可以很好的考察考生在新情境下获取信息的理解能力、解决问题能力、实验探究能力和创新能力。生物工程主要考察细胞工程、胚胎工程和基因工程三部分内容。细胞工程主要考察动物细胞工程中单克隆抗体的相关知识；胚胎工程主要结合优良牲畜的繁育情境进行综合进行考察，与生产生活联系密切；基因工程因其与遗传部分联系密切，成为高考必考内容，而且难度一般较大，题目情景也较为复杂，与当前前沿科技联系密切。
三、备考时要注意关注生产生活实践，关注传统文化；关注科学实验、科技前沿。众多科学实验为实验探究类题目提供了情景载体，此类题目综合考察考生在新情境下获取信息的理解能力，综合运用知识解决问题的能力，进行实验设计、分析等的实验探究能力和创新能力；关注生态问题，倡导绿色发展理念，提升生态意识。从近几年高考题变化来看，要以教材为基础，抓牢基础知识和基本概念的教学。试题对教材中概念的细节考察越来越突出，生物学关键词更是得分要点。教学中应引导学生关注教材细节内容，落实好对基本概念、基础知识的学习、理解和应用。
典例一：发酵工程
1.（2021·湖南·高考真题）大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12~38kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。回答下列问题：
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以 为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于 培养基。
（2）配制的培养基必须进行 灭菌处理，目的是 。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是 。
（3）简要写出测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数的实验思路 。
（4）为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株 ，理由是 。
菌株 秸秆总重(g) 秸秆残重(g) 秸秆失重（%） 纤维素降解率（%）
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
2.（2023·全国·高考真题）某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆（清水淋洗时菌T不会流失），在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵（酒精发酵）。实验流程如图所示。

回答下列问题。
在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是
。
采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是 （答出1点即可）。通常，可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。在使用该方法时，为了达到良好的灭菌效果，需要注意的事项有
（答出2点即可）。
(3)将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。拧紧瓶盖的主要目的是 。但是在酵母菌发酵过程中，还需适时拧松瓶盖，原因是 。发酵液中的乙醇可用 溶液检测。
(4)本实验收集的淋洗液中的 可以作为酵母菌生产乙醇的原料。与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，本实验中乙醇生产方式的优点是 。
1．理清“3”种传统食品的制作技术
2．培养基制备与微生物纯化技术
【易错提醒】　
(1)为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物实验一般会设置空白对照：随机取若干灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。
(2)观察菌落需用固体培养基，因此培养基要添加凝固剂，如琼脂。
(3)倒平板的温度一般在50 ℃左右较为适宜，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。
3．微生物分离与计数的实例
（2024·陕西商洛·模拟预测）反硝化细菌是一类能将硝态氮（NO3-—N）通过一系列中间产物（NO2-、NO、N2O）还原为气态氮（N2）的细菌群，反硝化作用也是产碱过程。反硝化细菌对于解决水体富营养化和亚硝酸盐对水生动物的毒害，具有十分重要的意义。某课题小组通过采集活性污泥样品，并从中分离反硝化细菌，研究影响菌株反硝化作用的主要环境因素，为反硝化细菌在养殖废水处理应用中提供理论指导。反硝化细菌的分离和鉴定流程如下，回答下列问题：
(1)将采集的活性污泥样品1mL加入到装有9mL、pH7．2的磷酸盐缓冲液的l00mL烧杯中，取样接种到富集培养基中培养，富集培养基的成分有：KNO32g，FeSO40．2g，KH2PO41．0g，MgSO40．5g，NaCl2g，CaCO35g，其中为反硝化细菌提供氮源的是 ，富集培养的目的是 。
(2)将富集后的样品进行梯度稀释后，使用 （填工具）将样液均匀涂布在BTB培养基（BTB培养基初始pH=6．8，BTB是酸碱指示剂，酸性条件下为黄色，中性条件下为绿色，碱性条件下为蓝色）上，每个稀释度下涂布3个培养基是为了 ，放在30℃环境中培养2~3天后，挑选周围显 色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。
(3)将液体培养基导入大试管中，将杜氏小试管倒立放入大试管中，试管中的气体排尽，接入纯菌株，30℃恒温培养5~7d，观察到小管内有气泡，检测到N20，即可鉴定纯菌株为目的菌。不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌，原因是 。
(4)向几组等量的灭菌后的反硝化培养基中分别以1%、3%、5%、7%和10%的接种量接入菌株N1，在30℃，120r/min摇床震荡培养，24h后测量NO3-—N等指标，结果如右图所示：
①本研究的目的是 。
②当投菌量达到 时，反硝化效果最好，NO3-—N和总脱氮率均较高。当投菌量继续增加，NO3-—N和总脱氮率反而下降，推测可能的原因是 （答1点）。
典例二：基因工程与生物技术的安全性与伦理性
1.（2023·辽宁·高考真题）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。

(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。

(5)目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR的模板。
2.（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的 组，样品2有特异性扩增产物，结果表明 。

(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。

(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高， ，最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为
。（答出两点即可）
1．基因工程的3种基本工具
2.熟记基因工程的四个操作步骤
3．PCR技术原理与条件
4．PCR技术的过程
5．治疗性克隆与生殖性克隆的关系
类型 项目 治疗性克隆 生殖性克隆
区别 目的 利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用于医学研究和治疗 利用克隆技术产生独立生存的新个体，获得人的复制品
水平 细胞水平 个体水平
联系 都属于无性生殖；产生的新细胞、组织、器官或新个体，遗传信息相同
6.区分试管婴儿和设计试管婴儿
(1)设计试管婴儿比试管婴儿多出的是过程④(遗传学诊断)。
(2)试管婴儿主要解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗。
(3)两者都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
（2024·山东烟台·一模）哺乳动物体内一定含量的w-3多不饱和脂肪酸(LCPUFA)可以起到预防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1(1229bp),培育转fat-1基因家兔，其部分流程如图一所示。
(1)PCR扩增fat-1基因的前提是 ，以用于特异性制备PCR扩增需要的引物。PCR扩增过程中，经过4轮循环后，得到的产物中只含一种引物的DNA分子占比为 。
(2)在构建PEBf质粒时，为确保fat-1基因按正确方向插入，需要双酶切，还需对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为a链，与b链结合的引物5'端添加了限制酶识别序列GAATTC,则另一引物5’端需添加的限制酶识别序列为 ,理由是
。
(3)转染是将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功，科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA，利用fat-1基因引物进行PCR扩增后电泳，部分结果如图二所示。据图分析，1组和2组分别是 细胞组PCR产物。
(4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用 技术。如果fat-1基因已正确插入PEB质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA合成酶，从构建基因表达载体的角度分析，可能的原因是 。
典例三：细胞工程与基因工程综合考查
1.（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。

回答下列问题。
(1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注 。
(3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是
。
与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是
（答出2点即可）。
2.（2022·福建·高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：
（一）基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH与加入的脱氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。

(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1所示。用Xho I和Sal 1分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是 。
培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
（二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图2所示：

(3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。
(4)步骤②所用的SP2/0细胞的生长特点是 。
(5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入 进行专一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体，原因是
。
(6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14抗体，用于检测巨噬细胞。
3.（2022·全国·高考真题）某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊，为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代，该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题，
(1)为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是 。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是 ；精子体外获能可采用化学诱导法，诱导精子获能的药物是 （答出1点即可）。利用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞，因为卵母细胞达到 时才具备与精子受精的能力。
(2)体外受精获得的受精卵发育成囊胚需要在特定的培养液中进行，该培养液的成分除无机盐、激素、血清外，还含的营养成分有 （答出3点即可）等。将培养好的良种囊胚保存备用。
(3)请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是 。
1．植物组织培养的过程——原理：植物细胞的全能性
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。
2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
3．动物细胞培养(以贴壁细胞为例)——原理：细胞增殖
(1)动物细胞培养过程
①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来分散成单个细胞。
②保障无菌、无毒的措施：对培养液和培养用具进行灭菌处理及在无菌条件下进行操作，定期更换培养液。
③区分原代培养和传代培养的关键：是否分瓶培养。
4.单克隆抗体的制备——原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖
(1)3种细胞特点不同：①B淋巴细胞：能产生抗体，不能大量增殖。②骨髓瘤细胞：能迅速大量增殖，不能产生抗体。③杂交瘤细胞：既能产生抗体，又能迅速大量增殖。
(2)两次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。
5．动物体细胞核移植技术——原理：动物细胞核的全能性
(1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。③外界环境可能引起不可遗传的变异。
(2)克隆动物的产生是无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。
6．准确记忆哺乳动物的早期胚胎发育过程
(1)受精过程中的两个标志：受精的标志是观察到两个极体或雌雄原核；受精完成的标志是雌雄原核融合完成。
(2)桑葚胚是由受精卵分裂形成的，没有分化；而囊胚期虽然已进行细胞分化，但囊胚的内细胞团仍具有全能性。
7．胚胎移植的操作流程
(1)胚胎移植过程中的两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母畜是否妊娠进行检查。
(2)胚胎移植产生的后代是有性生殖还是无性生殖，取决于胚胎发育的起点。若后代是由受精卵形成的，则为有性生殖；若后代是由核移植技术形成的重组细胞或胚胎分割形成的胚胎发育而成，则为无性生殖。
(3)用于移植的胚胎来源：体内正常受精的胚胎、核移植的胚胎和体外受精获得的胚胎、转基因获得的胚胎、胚胎分割获得的胚胎等。
(4)胚胎存活的基础：受体不会对来自供体的胚胎发生免疫排斥反应。
（2024·湖南衡阳·模拟预测）双特异性单克隆抗体是指可同时与癌细胞和药物结合的特异性抗体。下图是科研人员通过杂交瘤细胞技术（免疫的B细胞和骨髓瘤细胞杂交技术）生产能同时识别癌胚抗原和长春碱（一种抗癌药物）的双特异性单克隆抗体的部分过程。回答下列问题：

(1)过程①处理后 （填“需要”或“不需要”）对小鼠进行抗体检测，理由是 。
(2)过程②常用灭活的病毒来诱导融合，其作用机理是 。
(3)过程③得到的杂交瘤细胞的特征是 。
(4)过程④一般在多孔细胞培养板上进行：先将细胞悬浮液稀释到7～10个细胞/mL，再在每个培养孔中滴入0．1mL细胞稀释液，其目的是 。
(5)请简述图中过程⑤的操作目的 。
1．（2023·北京·高考真题）自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
(1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供
和维生素等。
(2)A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊（如图），表明 。
(3)为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样 后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现 。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
(4)为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证（主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱）
。
2．（2023·重庆·高考真题）妊娠与子宫内膜基质细胞的功能密切相关。某研究小组通过如图所示的实验流程获得了子宫内膜基质细胞，以期用于妊娠相关疾病的研究。

(1)手术获得的皮肤组织需在低温下运至实验室，低温对细胞中各种蛋白质的作用为 。
(2)过程①中，诱导形成PS细胞时，需提高成纤维细胞中4个基因的表达量，可采用 技术将这些基因导入该细胞。这4个基因的主要作用为：M基因促进增殖，S基因和C基因控制干细胞特性，K基因抑制凋亡和衰老。若成纤维细胞形成肿瘤细胞，最有可能的原因是 基因过量表达。
(3)培养iPS细胞时，应对所处环境定期消毒以降低细胞被污染风险。可用紫外线进行消毒的是_ ____（多选）。
A．培养基 B．培养瓶 C．细胞培养室 D．CO2培养箱
(4)过程②中，iPS细胞经历的生命历程为 。PCR技术可用于检测子宫内膜基质细胞关键基因的mRNA水平，mRNA需经过 才能作为PCR扩增的模板。
3．（2023·天津·高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。

(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA基因进行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。

（ii）切去UGA基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。

4．（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。

(3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
5．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。

(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
6．（2023·浙江·高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生
，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
7．（2023·全国·高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
。
8．（2023·湖南·高考真题）某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题：
(1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和 。
(2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好，若要确定其有抑菌效果的最低浓度，需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。
测试菌 抗菌肽浓度/（ g mL-1）
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
金黄色葡萄球菌 - - - - - + +
枯草芽孢杆菌 - - - - - + +
禾谷镰孢菌 - + + + + + +
假丝酵母 - + + + + + +
注：“+”表示长菌，“-”表示未长菌。
(3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体，转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 （答出两点即可）。
(4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体，如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 （答出两点）等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术 （填“是”或“否”）。

(5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种耐药菌，严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。
①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体 ②MRSA感染的肺类装配体 ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽 ④生理盐水 ⑤青霉素（抗金黄色葡萄球菌的药物） ⑥万古霉素（抗MRSA的药物）
9.（2022·湖南·高考真题）黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发酵酒的酿造过程中除了产生乙醇外，也产生不利于人体健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素与乙醇反应形成，各国对酒中的EC含量有严格的限量标准。回答下列问题:
(1)某黄酒酿制工艺流程如图所示，图中加入的菌种a是 ，工艺b是 （填“消毒”或“灭菌”），采用工艺b的目的是 。
(2)以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂，根据颜色变化，可以初步鉴定分解尿素的细菌。尿素分解菌产生的脲酶可用于降解黄酒中的尿素，脲酶固定化后稳定性和利用效率提高，固定化方法有 （答出两种即可）。
(3)研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌L，在不同条件下分批发酵生产脲酶，结果如图所示。推测 是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素，理由是 。
(4)某公司开发了一种新的黄酒产品，发现EC含量超标。简要写出利用微生物降低该黄酒中EC含量的思路 。
10.（2023·湖北·高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。

回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和 生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。

1.（2024·云南昭通·模拟预测）今年4月27日，大熊猫“丫丫”回国在社会上引起了巨大反响。自然状态下的大熊猫繁殖能力较低，曾一度濒临灭绝，我国科学家利用胚胎工程的技术手段大大提高了熊猫的繁殖率，目前我国的熊猫数量已经有2400余只。请回答下列问题：
(1)大熊猫主要以竹子为食，研究人员为了从大熊猫粪便中筛选出纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以 为唯一碳源的固体培养基上进行培养。配制的培养基可用 方法进行灭菌处理。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是 。
(2)大熊猫体内受精受孕率低，可利用体外受精。受精前需要对采集的精子进行 处理，收集的卵母细胞要培养至 期。
(3)为了进一步提高熊猫的产子率，科学家用了胚胎分割技术，该技术属于 （填“有性”或“无性”）生殖，进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的 。胚胎移植前有时需进行性别鉴定，目前SRY-PCR技术是哺乳动物性别鉴定最有效的方法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取 细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基序列作为 ，用被测胚胎DNA作模板进行PCR扩增，若通过鉴定，出现阳性反应的胚胎为雄性。
2．（2024·河南开封·二模）苹果不仅味道香甜，还具有很高的营养价值。用苹果发酵的果酒具有加速新陈代谢、活血通络、通便减肥等多种作用。图1为简易的发酵瓶，图2为细胞呼吸的相关代谢途径。请回答下列问题。
(1)从微生物培养的角度看，作为培养基的苹果汁能够为酵母菌提供的营养物质有 。
(2)将苹果汁、酵母菌等原料装入图1所示发酵瓶，然后塞好瓶塞，夹紧进气管和出气管，在适宜的温度条件下静置。该过程中，发酵瓶内酵母菌可进行图2中的 （选填编号）过程。
(3)请在坐标图中，绘制酿造苹果酒的过程中发酵瓶内酵母菌的种群数量变化曲线（绘出变化趋势即可） 。酵母菌的数量测定可以用稀释涂布平板法进行，其中使酵母菌液在培养基表面均匀分布的操作是 。也可以用 计数板对酵母菌进行计数。
(4)若将酿好的苹果酒置于30～35℃温度条件下，将发酵瓶的进气管、出气管分别 ，再加入适量的醋酸菌，一段时间后酒味会逐渐消失并出现醋酸味，苹果酒逐渐转变为苹果醋。其主要原因是 。
(5)若在制作苹果酒之前，打开图1中进气管、出气管一段时间，其意图与发酵工程基本环节中的
目的一致。
3．（2024·北京密云·模拟预测）三白草和鱼腥草是同科不同属的两种药用植物，二者因疗效相近且具有叠加效应常被用作“药对”。科研人员将复方的配伍（两种或两种以上药物配合使用）用到个体生长或生产过程，并实现有效成分的工厂化生产的具体操作如图1，进一步研究不同的原生质体密度对三白草和鱼腥草原生质体融合率的影响，结果如图2。

(1)图1中①过程通过酶解法去除 获取原生质体，并向三白草和鱼腥草细胞酶解液中分别加入红、绿荧光色素（带荧光色素的原生质体仍能融合和再生）。过程②利用化学诱导剂 诱导融合，随后在荧光显微镜下选择带 的杂种原生质体。
(2)由图2可知，促进三白草和鱼腥草原生质体融合的最适密度为 个/mL。
(3)通常情况下，能增加免疫器官的重量表明该物质具有一定的增强免疫力的作用。为判断融合体对动物免疫力的影响，科研人员取同种小鼠30只，雌雄各半，随机均分为三组，实验处理如下表。
组别 A组 B组 C组（空白对照组）
实验处理 三白草和鱼腥草杂种愈伤组织的蒸馏水提取物 三白草和鱼腥草直接混合后的蒸馏水提取物
每天一次等量灌胃，连续一周，检测各组小鼠的胸腺重量
①表格中C组的实验处理为 。
②若实验结果为 ，则支持利用原生质体融合技术将复方的配伍提前并实现有效成分的工厂化生产。
4.（2023·山西太原·二模）科学家计划将发光基因导入夹竹桃，将发光的夹竹桃种植到高速公路的两旁，到那时，每当夜幕降临，公路两旁的夹竹桃荧光闪闪，树树相连，公路将变成美丽的荧光世界。下图是转基因发光夹竹桃的培育过程，含发光基因的DNA片段和Ti质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析并回答下列问题：
(1)若发光基因是从萤火虫细胞内提取的mRNA逆转录形成的，则发光基因中 （填“含有”或“不含”）启动子。利用PCR技术扩增发光基因时，需依据 合成引物，扩增发光基因的过程中，DNA解旋为单链后要适当 （填“升高”或“降低”）反应体系温度，以便引物与模板结合。
(2)发光基因应导入Ti质粒的 上，用图中的Ti质粒和发光基因构建重组质粒时，不宜仅使用BamHⅠ酶切割，原因是 ，应选用 酶对外源DNA片段、Ti质粒进行切割。
(3)Ti质粒上的四环素抗性基因的作用是 ，将转基因发光夹竹桃细胞培养成幼苗，要经过⑤⑥ 两个过程。
5．（2024·宁夏银川·一模）我国科学家突破了体细胞克隆猴的世界难题，成功培育出世界上首个体细胞克隆猴——“中中”和“华华”。这标志着我国将率先开启以猕猴作为实验动物模型的时代。如图为克隆猴的流程示意图。请回答下列问题：

(1)我国克隆猴利用的是猴胎儿成纤维细胞，该细胞是一种已分化的体细胞，从理论上分析，它具有细胞的全能性，这是因为 。
(2)克隆猴时需要进行“去核”操作，即去掉卵母细胞的细胞核。先在体外培养卵母细胞让其分裂，一般选择 的细胞进行去核操作；然后进行“核移植”，即将体细胞的细胞核移到去核卵母细胞中形成重组细胞；此时采用的技术是 ；得到的重组细胞再进行人工激活使其分裂形成胚胎。
(3)科学家将79枚克隆胚胎移植到21只代孕母猴中，最终只有两只母猴正常怀孕产下“中中”和“华华”，它俩的性别是否一致？ ；原因是 。
(4)克隆动物有很多优点：①可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；② 。
6．（2024·甘肃·一模）利用体细胞核移植来克隆高产奶牛的大致流程如下图，其中 Kdm4d为组蛋白去甲基化酶。回答下列问题：
过程①应选用处于 的卵母细胞，采用显微操作法去“核”，其实是去除
。
(2)重构细胞经分裂、发育至 时期，可移植到受体母牛子宫中。移植之前，需要对受体母牛进行 处理。若要获得遗传性状完全相同的多只犊牛，可对重构胚进行 ，再进行移植。犊牛的表型不完全与高产奶牛 致，原因可能是 (答两点)。
(3)科研人员为确定 Kdm4d的 mRNA 的作用，进行了如下实验，其中 A 组用正常培养液培养重构胚，B组用正常培养液培养注入了 Kdm4d 的 mRNA 的重构胚，实验结果如图所示。根据实验结果推测 Kdm4d的mRNA的作用是 。
7．（2024·贵州·模拟预测）在植物基因工程中外源基因表达量不足是目前利用转基因植物生产植物疫苗时存在的问题之一。研究表明，启动子的串联能增强外源基因的表达，研究人员拟构建含有两个35s启动子（35s启动子是花椰菜花叶病毒的一种强启动子）串联的转基因苜蓿。一个35s启动子包括1个A区和2个B区。图甲表示35s启动子及其附近区域分布的限制酶识别位点，已知不同限制酶切割后得到的黏性末端各不相同。图乙表示待转入第二个35s启动子的重组质粒的构成组件及其上的限制酶识别位点。
(1)利用PCR技术可以扩增35s启动子，PCR技术的原理是 ，此技术设计引物很关键，引物是 。利用此技术扩增的35s启动子可以在PCR扩增仪中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物。
(2)根据限制酶识别位点，为了让第二个35s启动子准确串联在待转入的重组质粒上，应选择 限制酶切割图甲的DNA片段。
(3)为了筛选出正确串联了两个35s启动子的新重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，平板类型丙和丁加入的抗生素分别是 、 ，得到①②③三类菌落，其生长状况如下表（+代表生长，-表示不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填“①”“②”或“③”）类。若新获得的转基因苜蓿中目的基因的表达量大幅增加，可以说明串联两个35s启动子能 。
平板类型 ① ② ③
甲：无抗生素 + + +
乙：卡那霉素 - - +
丙：？ - + +
丁：？ - - +
8．（2024·山东聊城·一模）易错PCR是利用低保真的Taq酶和改变PCR的反应条件，降低DNA复制的准确性，在新DNA链的合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。从自然界中的生物体内分离得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。下图是研究人员利用易错PCR技术对某种天然酶进行改造，获得了高催化效率的酶的流程示意图。回答下列问题：

(1)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。PCR反应体系中需添加引物，引物的作用是 。
(2)图中步骤①为易错PCR过程，其扩增过程中需要加入Taq酶，这是因为Taq酶具有 的特点。图中步骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用 处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。转化是指 。
(3)Taq酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg2+可以提高该错配区的稳定性。因此，与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当 （填“提高”或“降低”）Mn2+浓度、 （填“提高”或“降低”）Mg2+浓度。
(4)阐述通过易错PCR技术改造天然酶与通过蛋白质工程改造天然酶原理的本质区别
。
9．（2024·陕西商洛·模拟预测）乙肝基因工程疫苗是用基因工程技术将乙型肝炎表面抗原基因片段（转录以β链为模板）重组到中国仓鼠卵巢细胞（CHO）内，通过细胞培养，使其大量分泌乙肝表面抗原（HBsAg）于培养液中，经纯化加佐剂氢氧化铝后制成。利用基因工程技术生产乙肝疫苗流程。回答下列问题：
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ
识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT
(1)根据图表，应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶 切割图中含乙型肝炎表面抗原基因的DNA片段，以获得能正确表达乙型肝炎表面抗原基因的重组质粒。
(2)研究人员欲对乙型肝炎表面抗原基因的mRNA进行RT—PCR，已知其mRNA的序列为5＇-UGAACGCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3＇。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为 。PCR反应体系中，需要加入Mg2+，目的是 。至少经过 次循环才能获得双链等长的乙型肝炎表面抗原基因。
(3)培养小鼠卵巢细胞时，首先应保证其处于 的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要控制的气体条件是 。检测小鼠卵巢细胞是否产生HBsAg，常用的方法是 。
10．（23-24高三下·湖南·阶段练习）在未断奶的小牛胃中存在一种凝乳酶，被广泛应用于奶酪和酸奶的生产。科学家将编码牛凝乳酶的基因（长度1.5kb）导入大肠杆菌获得工程菌，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。
(1)提取小牛胃黏膜组织中的mRNA，经逆转录得到cDNA，选择合适的引物进行PCR扩增，PCR引物碱基数一般在20～30个之间，过短则导致 。
(2)如表为操作过程中可能用到的限制酶，图1为获得的目的基因及末端（除黏性末端序列外，其他碱基序列省略），图2为要使用的质粒，其中的Tetr、Ampr分别为四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。对质粒进行切割时，选用的两种限制酶为 。目的基因和质粒能连接成重组质粒的原因是
，导入的目的基因在受体细胞中能成功表达的理论基础是 。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别位点及切割位点 —G↓GATCC— —T↓GATCG— —CCC↓GGG— —↓GATC—
(3)将转化后的大肠杆菌接种在含 的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如下图， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
(4)已知凝乳酶第20、24位氨基酸变成半胱氨酸，其活性可显著提高。科研人员希望运用蛋白质工程技术获得活性更强的凝乳酶，请选用合适的措施编号并排序： 。（用箭头表示）
①重组DNA分子导入大肠杆菌
②随机改变凝乳酶基因的序列
③分析突变蛋白功能，设计结构
④改变凝乳酶基因的特定序列
⑤培养细胞后提纯突变蛋白
⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组大题05 生物技术与工程
【高考真题分布】
考点 考向 高考考题分布
生物技术与工程 发酵工程综合考查； 细胞工程与基因工程综合考查； 基因工程与生物技术的安全性与伦理性 2023山东卷 2023湖南卷 2023辽宁卷 2023北京卷 2023天津卷 2023重庆卷 2023浙江卷 2023湖北卷 2023海南卷 2023河北卷 2022全国卷 2022湖南卷 2022福建卷 2022广东
【题型解读】
一、现代生物科技专题部分包括发酵工程、细胞工程和基因工程三大部分，是每年高考必考的内容。通过近3年试题分析发现，应用微生物的分离纯化技术以及基因工程、细胞工程和胚胎工程相结合的技术，可以解决很多社会关注度高的生产、生活、健康方面的热点问题。这使得生物技术与工程在赢得普通大众关注的同时，也赢得了高考命题专家的青睐，成为当下热门的高频考点。
二、生物科技专题题目呈现方式也多种多样，有坐标曲线，有图表，还有流程图及文字介绍。这些新情境类题目一般具有很高的陌生度，特别是山东卷等大量的专业术语和未知的新技术、新流程的出现，往往让考生不知所措。生物技术主要考察传统发酵技术和微生物培养两部分。传统发酵技术与生产生活实际联系密切，题目一般以生活、学习和实践作为学科情景来考察考生分析解决问题的能力。微生物培养对知识要点和操作的要求更高，题目难度也相应大一些。题目一般以科学实验和探究作为学科情境，考察考生的逻辑推理能力和实验探究能力。生物技术与工程方面的考题可以很好的考察考生在新情境下获取信息的理解能力、解决问题能力、实验探究能力和创新能力。生物工程主要考察细胞工程、胚胎工程和基因工程三部分内容。细胞工程主要考察动物细胞工程中单克隆抗体的相关知识；胚胎工程主要结合优良牲畜的繁育情境进行综合进行考察，与生产生活联系密切；基因工程因其与遗传部分联系密切，成为高考必考内容，而且难度一般较大，题目情景也较为复杂，与当前前沿科技联系密切。
三、备考时要注意关注生产生活实践，关注传统文化；关注科学实验、科技前沿。众多科学实验为实验探究类题目提供了情景载体，此类题目综合考察考生在新情境下获取信息的理解能力，综合运用知识解决问题的能力，进行实验设计、分析等的实验探究能力和创新能力；关注生态问题，倡导绿色发展理念，提升生态意识。从近几年高考题变化来看，要以教材为基础，抓牢基础知识和基本概念的教学。试题对教材中概念的细节考察越来越突出，生物学关键词更是得分要点。教学中应引导学生关注教材细节内容，落实好对基本概念、基础知识的学习、理解和应用。
典例一：发酵工程
1.（2021·湖南·高考真题）大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12~38kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。回答下列问题：
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以 为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于 培养基。
（2）配制的培养基必须进行 灭菌处理，目的是 。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是 。
（3）简要写出测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数的实验思路 。
（4）为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株 ，理由是 。
菌株 秸秆总重(g) 秸秆残重(g) 秸秆失重（%） 纤维素降解率（%）
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
【答案】
C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 纤维素 选择
高压蒸汽
为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子） 不接种培养（或空白培养 ）
将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1mL涂布到若干个平板（每个稀释度至少涂布三个平板），对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测 大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数
C 接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大
【分析】
1、分解纤维素的微生物分离的实验原理：
（1）土壤中存在着大量纤维素分解酶，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，可以把纤维素分解为纤维二糖，进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用，故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长；
（2）在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。
2、消毒和灭菌：
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象 操作空间、某些液体、双手等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
【详解】
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养；培养基从功能上分类可分为选择培养基和鉴别培养基，故该培养基从功能上分类属于选择培养基。
（2）配制培养基的常用高压蒸汽灭菌，即将培养基置于压力100 kPa、温度121℃条件下维持15～30分钟，目的是为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）。为检测灭菌效果可对培养基进行空白培养，即将未接种的培养基在适宜条件下培养一段时间，若在适宜条件下培养无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。
（3）为测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数，常采用稀释涂布平板法，在适宜的条件下对大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌进行纯化并计数时，对照组应该涂布等量的无菌水。将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1mL涂布到若干个平板（每个稀释度至少涂布三个平板），对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数。
（4）测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。由表格可知，在适宜的条件下，C菌株在相同的温度和时间下，秸秆失重最多，纤维素降解率最大，说明该菌株的纤维素分解菌产生的纤维素酶活力最大。
【点睛】本题考查微生物的实验室培养，要求考生识记计数微生物的方法；识记培养基的种类及功能；掌握纤维素分解分离和鉴别的原理，能结合所学的知识准确答题。
2.（2023·全国·高考真题）某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆（清水淋洗时菌T不会流失），在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵（酒精发酵）。实验流程如图所示。

回答下列问题。
在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是
。
采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是 （答出1点即可）。通常，可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。在使用该方法时，为了达到良好的灭菌效果，需要注意的事项有
（答出2点即可）。
(3)将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。拧紧瓶盖的主要目的是 。但是在酵母菌发酵过程中，还需适时拧松瓶盖，原因是 。发酵液中的乙醇可用 溶液检测。
(4)本实验收集的淋洗液中的 可以作为酵母菌生产乙醇的原料。与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，本实验中乙醇生产方式的优点是 。
【答案】
(1)菌T能够分泌纤维素酶
(2)为合成微生物细胞结构提供原料（微生物细胞中的含氮物质，如核酸、蛋白质、磷脂） ①把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除；②为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15~30 min；③无菌包不宜过大，不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央，有利于蒸汽流通；④灭菌完成后，应使锅内蒸气压力缓慢降低，排气时间不少于10一12分钟。
(3) 制造无氧环境 排出二氧化碳 酸性的重铬酸钾溶液
(4) 葡萄糖 节约粮食、废物利用、清洁环保、不污染环境、生产成本低、原料来源广
【分析】果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。故果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，酵母菌最适宜生长繁殖的温度范围是18～30℃；生产中是否有酒精的产生，可用酸性重铬酸钾来检验，该物质与酒精反应呈现灰绿色。
【详解】
（1）菌T能够分泌纤维素酶，纤维素酶能将纤维素最终分解为葡萄糖，因此在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解。
（2）培养基的主要成分：水、碳源、氮源、无机盐，其中氮源主要为合成微生物的细胞结构提供原料（微生物细胞中的含氮物质，如核酸、蛋白质、磷脂）。 高压蒸汽灭菌法的注意的事项有①把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后，将锅密闭，如果高压锅内的空气未排除或未完全排除，则蒸汽不能达到饱和，蒸汽的温度未达到要求的高度，结果导致灭菌的失败；②为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15~30 min；③无菌包不宜过大，不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央，有利于蒸汽流通；④灭菌完成后，应使锅内蒸气压力缓慢降低，排气时间不少于10一12分钟，否则锅内蒸气压力突然降低，液体突然沸腾，冲走瓶盖，使液体喷出或使容器破裂。
（3）果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，将酵母菌接种到灭菌后的培养基中进行酒精发酵，酒精发酵需要在无氧的条件下进行，此时拧紧瓶盖的主要目的是制造无氧环境。酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，在发酵过程中密闭，所以需要根据发酵进程适时拧松瓶盖放出二氧化碳，酒精可用酸性重铬酸钾溶液来检测，该物质与酒精反应呈现灰绿色。
（4）与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，利用纤维素为原料生产乙醇具有节约粮食、废物利用、清洁环保、不污染环境、生产成本低、原料来源广等优点。
1．理清“3”种传统食品的制作技术
2．培养基制备与微生物纯化技术
【易错提醒】　
(1)为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物实验一般会设置空白对照：随机取若干灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。
(2)观察菌落需用固体培养基，因此培养基要添加凝固剂，如琼脂。
(3)倒平板的温度一般在50 ℃左右较为适宜，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。
3．微生物分离与计数的实例
（2024·陕西商洛·模拟预测）反硝化细菌是一类能将硝态氮（NO3-—N）通过一系列中间产物（NO2-、NO、N2O）还原为气态氮（N2）的细菌群，反硝化作用也是产碱过程。反硝化细菌对于解决水体富营养化和亚硝酸盐对水生动物的毒害，具有十分重要的意义。某课题小组通过采集活性污泥样品，并从中分离反硝化细菌，研究影响菌株反硝化作用的主要环境因素，为反硝化细菌在养殖废水处理应用中提供理论指导。反硝化细菌的分离和鉴定流程如下，回答下列问题：
(1)将采集的活性污泥样品1mL加入到装有9mL、pH7．2的磷酸盐缓冲液的l00mL烧杯中，取样接种到富集培养基中培养，富集培养基的成分有：KNO32g，FeSO40．2g，KH2PO41．0g，MgSO40．5g，NaCl2g，CaCO35g，其中为反硝化细菌提供氮源的是 ，富集培养的目的是 。
(2)将富集后的样品进行梯度稀释后，使用 （填工具）将样液均匀涂布在BTB培养基（BTB培养基初始pH=6．8，BTB是酸碱指示剂，酸性条件下为黄色，中性条件下为绿色，碱性条件下为蓝色）上，每个稀释度下涂布3个培养基是为了 ，放在30℃环境中培养2~3天后，挑选周围显 色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。
(3)将液体培养基导入大试管中，将杜氏小试管倒立放入大试管中，试管中的气体排尽，接入纯菌株，30℃恒温培养5~7d，观察到小管内有气泡，检测到N20，即可鉴定纯菌株为目的菌。不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌，原因是 。
(4)向几组等量的灭菌后的反硝化培养基中分别以1%、3%、5%、7%和10%的接种量接入菌株N1，在30℃，120r/min摇床震荡培养，24h后测量NO3-—N等指标，结果如右图所示：
①本研究的目的是 。
②当投菌量达到 时，反硝化效果最好，NO3-—N和总脱氮率均较高。当投菌量继续增加，NO3-—N和总脱氮率反而下降，推测可能的原因是 （答1点）。
【答案】
(1) KNO3 对反硝化细菌进行扩增
(2) 涂布器 设置重复，取平均值，减少实验误差 蓝
(3)其他微生物也能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低
(4) 探究反硝化细菌投菌量（接种量）对反硝化效果的影响 5% 投菌量过大，使培养基中的碳源很快消耗完，细菌数量下降；或是由于投菌量过大，耗氧速度加快，使体系中氧气供应不足，不利于细菌生长和代谢
【分析】微生物接种常用的两种方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过足够稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后，可形成单菌落。
【详解】
（1）培养基的成分主要包括碳源、氮源、水、无机盐等，培养基中KNO3含有N，可以提供氮源。富集培养的目的是对反硝化细菌进行扩增，增加目的菌落的数量。
（2）稀释涂布平板法用到涂布器将样液均匀涂布在BTB培养基上，每个稀释度下涂布3个培养基是为了设置重复，取平均值，减少实验误差；分析题干，反硝化细菌可以产生碱性物质，BTB是酸碱指示剂碱性条件下为蓝色，放在30℃环境中培养2~3天后，挑选周围显蓝色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。
（3）反硝化细菌和其他微生物都能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低，因此不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌。
（4）①分析题干，该实验的自变量是菌株N1的接种量，因变量是反硝化效果，因此可知，本研究的目的是探究反硝化细菌投菌量（接种量）对反硝化效果的影响；
②分析图，当投菌量达到5%时，反硝化效果最好，NO3-—N和总脱氮率均较高。当投菌量继续增加，NO3-—N和总脱氮率反而下降，因为投菌量过大，使培养基中的碳源很快消耗完，细菌数量下降；或是由于投菌量过大，耗氧速度加快，使体系中氧气供应不足，不利于细菌生长和代谢。
典例二：基因工程与生物技术的安全性与伦理性
1.（2023·辽宁·高考真题）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。

(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。

(5)目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR的模板。
【答案】
(1)蛋白质
(2)③
(3)②
(4)标记基因
(5) 筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
(6)逆转录
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
（2）PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐热的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。
2.（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的 组，样品2有特异性扩增产物，结果表明 。

(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。

(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高， ，最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为
。（答出两点即可）
【答案】
(1)溶解度
(2) 启动子 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序） 苹果酸酶基因（或“ME基因”）
(3) 碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”）
(4) 增加 细胞数量
(5)有氧呼吸生成的ATP增多
(6)节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”）
【分析】
1、PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2、PCR原理：DNA半保留复制。
3、PCR基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷三磷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。
【详解】
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。因此，根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的粗提DNA可以作为PCR扩增目的基因的模板。
（2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有特殊序列结构的DNA片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果酸酶（ME）基因。
（3）PCR是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA作为PCR模板，而在实验组中以转ME基因的硅藻细胞基因组DNA作为模板。如此比较两个实验扩增结果可以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME基因序列是否整合到硅藻细胞基因组中。
（4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3分析可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A与B的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高产生物柴油的优良硅藻细胞品系。
（5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析可知，ME基因的超表达导致线粒体中的NADH水平升高，NADH进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。
（6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。
1．基因工程的3种基本工具
2.熟记基因工程的四个操作步骤
3．PCR技术原理与条件
4．PCR技术的过程
5．治疗性克隆与生殖性克隆的关系
类型 项目 治疗性克隆 生殖性克隆
区别 目的 利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用于医学研究和治疗 利用克隆技术产生独立生存的新个体，获得人的复制品
水平 细胞水平 个体水平
联系 都属于无性生殖；产生的新细胞、组织、器官或新个体，遗传信息相同
6.区分试管婴儿和设计试管婴儿
(1)设计试管婴儿比试管婴儿多出的是过程④(遗传学诊断)。
(2)试管婴儿主要解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗。
(3)两者都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
（2024·山东烟台·一模）哺乳动物体内一定含量的w-3多不饱和脂肪酸(LCPUFA)可以起到预防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1(1229bp),培育转fat-1基因家兔，其部分流程如图一所示。
(1)PCR扩增fat-1基因的前提是 ，以用于特异性制备PCR扩增需要的引物。PCR扩增过程中，经过4轮循环后，得到的产物中只含一种引物的DNA分子占比为 。
(2)在构建PEBf质粒时，为确保fat-1基因按正确方向插入，需要双酶切，还需对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为a链，与b链结合的引物5'端添加了限制酶识别序列GAATTC,则另一引物5’端需添加的限制酶识别序列为 ,理由是
。
(3)转染是将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功，科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA，利用fat-1基因引物进行PCR扩增后电泳，部分结果如图二所示。据图分析，1组和2组分别是 细胞组PCR产物。
(4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用 技术。如果fat-1基因已正确插入PEB质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA合成酶，从构建基因表达载体的角度分析，可能的原因是 。
【答案】
(1) 获得一段已知目的基因的序列 1/8
(2) GGATCC 另一引物应和a链配对，且转录的模板链是a链，则a链引物所在一侧应靠近启动子，所以应选择BamH I限制酶的序列作为引物5’端序列，即另一引物5’端需添加的限制酶序列为GGATCC
(3)未成功转染和成功转染
(4) 抗原-抗体杂交 重组质粒缺少启动子和终止子，无法正常转录
【分析】
1、PCR扩增：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此循环多次。
2、选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。
【详解】
（1）在进行PCR扩增目的基因时，需要加入引物，引物是根据一段已知目的基因的序列合成的DNA片段。PCR扩增过程中，经过4轮循环后，得到16个DNA分子，其中有2个DNA分子只有含有母链，且该DNA分子只含一种引物，故得到的产物中只含一种引物的DNA分子占比为1/8。
（2）在构建PEBf质粒时，为确保fat-1基因按正确方向插入，需要双酶切，还需对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为a链，与b链结合的引物5'端添加了限制酶识别序列GAATTC,另一引物应和a链配对，且转录的模板链是a链，则a链引物所在一侧应靠近启动子，所以应选择BamH I限制酶的序列作为引物5’端序列，即另一引物5’端需添加的限制酶识别序列序列为GGATCC。
（3）据图分析，M2组和1组没有扩增出DNA片段，故细胞内不存在目的基因，即可能是细胞内导入PEB质粒或者未成功转染，而M2组是PEB质粒转染细胞PCR产物，故1组是未转染细胞PCR产物，2组出现一条DNA条带，即为目的基因条带，则细胞内导入的是PEBf质粒，1组和2组分别是未成功转染和成功转染细胞组PCR产物。
（4）检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用抗原-抗体杂交技术。如果fat-1基因已正确插入PEB质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA合成酶，从构建基因表达载体的角度分析，基因正确插入却无法检测到相应蛋白质，考虑目的基因未正确表达，从构建基因表达载体的角度分析，可能的原因是重组质粒缺少启动子和终止子，无法正常转录。
典例三：细胞工程与基因工程综合考查
1.（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。

回答下列问题。
(1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注 。
(3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是
。
与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是
（答出2点即可）。
【答案】
(1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
(2) 遗传特性 转基因标识
(3)Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
(4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除
(5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【分析】植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、芽，最终形成植物体。植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。
【详解】
（1）图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。
（2）图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。
（3）图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti质粒的作用，Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS缺失会导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。
（5）与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
2.（2022·福建·高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：
（一）基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH与加入的脱氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。

(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1所示。用Xho I和Sal 1分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是 。
培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
（二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图2所示：

(3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。
(4)步骤②所用的SP2/0细胞的生长特点是 。
(5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入 进行专一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体，原因是
。
(6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14抗体，用于检测巨噬细胞。
【答案】
(1)5'→3'
(2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）
(3) CD14蛋白/CD14抗原 分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞
(4)能在体外无限增殖
(5) CD14蛋白 参与形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类多，有的不能分泌抗CD14抗体
(6)小鼠腹水
【分析】
1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】
（1）PCR扩增时，DNA聚合酶催化引物的3'-OH与加入的脱氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯键，因此新链合成的方向是从5'→3'。
（2）可进一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ对CD14的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）。
（3）步骤①是注射特定抗原，针对本实验目的可知，要获得抗CD14单克隆抗体，故应该注射CD14蛋白/CD14抗原；步骤⑤是将分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞注入小鼠体内培养，以获得大量单克隆抗体。
（4）步骤②所用的SP2/0细胞是骨髓瘤细胞，特点是能在体外无限增殖。
（5）根据抗原—抗体杂交原理，应该用CD14蛋白检测其中是否含抗CD14蛋白的抗体。因为形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类很多，因此有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体。
（6）从制备单克隆抗体的流程可知，将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，最终要从小鼠的腹水中提取抗CD14抗体。
3.（2022·全国·高考真题）某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊，为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代，该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题，
(1)为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是 。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是 ；精子体外获能可采用化学诱导法，诱导精子获能的药物是 （答出1点即可）。利用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞，因为卵母细胞达到 时才具备与精子受精的能力。
(2)体外受精获得的受精卵发育成囊胚需要在特定的培养液中进行，该培养液的成分除无机盐、激素、血清外，还含的营养成分有 （答出3点即可）等。将培养好的良种囊胚保存备用。
(3)请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是 。
【答案】
(1) 冷冻保存 刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力 肝素或钙离子载体A23187 MⅡ中期
(2)维生素、氨基酸、核苷酸
(3)对受体母羊进行发情处理，合适的时间，将保存的囊胚移植入受体母羊的子宫
【分析】试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经移植后产生后代的技术。
【详解】
（1）精液可以冷冻保存，使用前再将精液解冻离心分离。刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力，故在体外受精前要对精子进行获能处理。通常采用的体外获能方法有培养法和化学诱导法，化学诱导法是将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物诱导精子获能。卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期（MⅡ中期）才能具备与精子受精的能力。
（2）进行早期胚胎培养的培养液中，除了无机盐、激素、血清外，还含有维生素、氨基酸、核苷酸等。
（3）要利用保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料，获得具有该公羊优良性状的后代，主要是利用胚胎移植技术，即对受体母羊进行发情处理，将保存的囊胚进行胚胎移植，对受体母羊进行是否妊娠的检查，一段时间后受体母羊产下具有该公羊优良性状的后代。
1．植物组织培养的过程——原理：植物细胞的全能性
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。
2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
3．动物细胞培养(以贴壁细胞为例)——原理：细胞增殖
(1)动物细胞培养过程
①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来分散成单个细胞。
②保障无菌、无毒的措施：对培养液和培养用具进行灭菌处理及在无菌条件下进行操作，定期更换培养液。
③区分原代培养和传代培养的关键：是否分瓶培养。
4.单克隆抗体的制备——原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖
(1)3种细胞特点不同：①B淋巴细胞：能产生抗体，不能大量增殖。②骨髓瘤细胞：能迅速大量增殖，不能产生抗体。③杂交瘤细胞：既能产生抗体，又能迅速大量增殖。
(2)两次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。
5．动物体细胞核移植技术——原理：动物细胞核的全能性
(1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。③外界环境可能引起不可遗传的变异。
(2)克隆动物的产生是无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。
6．准确记忆哺乳动物的早期胚胎发育过程
(1)受精过程中的两个标志：受精的标志是观察到两个极体或雌雄原核；受精完成的标志是雌雄原核融合完成。
(2)桑葚胚是由受精卵分裂形成的，没有分化；而囊胚期虽然已进行细胞分化，但囊胚的内细胞团仍具有全能性。
7．胚胎移植的操作流程
(1)胚胎移植过程中的两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母畜是否妊娠进行检查。
(2)胚胎移植产生的后代是有性生殖还是无性生殖，取决于胚胎发育的起点。若后代是由受精卵形成的，则为有性生殖；若后代是由核移植技术形成的重组细胞或胚胎分割形成的胚胎发育而成，则为无性生殖。
(3)用于移植的胚胎来源：体内正常受精的胚胎、核移植的胚胎和体外受精获得的胚胎、转基因获得的胚胎、胚胎分割获得的胚胎等。
(4)胚胎存活的基础：受体不会对来自供体的胚胎发生免疫排斥反应。
（2024·湖南衡阳·模拟预测）双特异性单克隆抗体是指可同时与癌细胞和药物结合的特异性抗体。下图是科研人员通过杂交瘤细胞技术（免疫的B细胞和骨髓瘤细胞杂交技术）生产能同时识别癌胚抗原和长春碱（一种抗癌药物）的双特异性单克隆抗体的部分过程。回答下列问题：

(1)过程①处理后 （填“需要”或“不需要”）对小鼠进行抗体检测，理由是 。
(2)过程②常用灭活的病毒来诱导融合，其作用机理是 。
(3)过程③得到的杂交瘤细胞的特征是 。
(4)过程④一般在多孔细胞培养板上进行：先将细胞悬浮液稀释到7～10个细胞/mL，再在每个培养孔中滴入0．1mL细胞稀释液，其目的是 。
(5)请简述图中过程⑤的操作目的 。
【答案】
(1) 需要 确保小鼠已产生分泌识别癌胚抗原（相应）抗体的浆细胞（B淋巴细胞）
(2)使细胞互相凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(3)既能迅速大量繁殖，又能产生抗体
(4)使每个培养孔尽量只接种一个杂交瘤细胞
(5)获取能产所需双特异性单克隆抗体的单克隆杂交-杂交瘤细胞
【分析】单克隆抗体制备流程：
对小鼠注射特定的抗原使小鼠产生免疫反应；
从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；
将小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，再用特定的选择培养基进行筛选；
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长；
对上述杂交瘤细胞还需进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选就可获得足量的能分泌所需抗体的细胞；
（6）最后，将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。这样从细胞培养液或小鼠腹水中，就可以提取出大量的单克隆抗体。
【详解】
（1）分析题图可知，过程①是给小鼠注射癌胚抗原，其目的是使小鼠产生能分泌识别癌胚抗原抗体的浆细胞，处理后需要对小鼠进行抗体检测，因为抗体和抗原的结合具有特异性，故可以通过抗体检测确保小鼠已产生分泌识别癌胚抗原（相应）抗体的浆细胞（B淋巴细胞）。
（2）分析题图可知，过程①是诱导小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，常用灭活的病毒来诱导融合，作用机理为使细胞互相凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（3）分析题图可知，过程③使用的HAT培养基为选择性培养基，通过筛选，只有杂交瘤细胞可以在此培养基生长，其他细胞如B淋巴细胞和骨髓瘤细胞均不能在HAT培养基上生长。故过程③得到的杂交瘤细胞的特征是既能迅速大量繁殖，又能产生抗体
（4）过程④一般在多孔细胞培养板上对过程③获得的杂交瘤细胞进行筛选和培养，可以获得产生单克隆抗体的细胞，在此过程中需要保证使每个培养孔尽量只接种一个杂交瘤细胞。
（5）过程⑤的操作目的是：获取能同时识别癌胚抗原和长春碱的双特异性单克隆抗体的单克隆杂交-杂交瘤细胞。
1．（2023·北京·高考真题）自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
(1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供
和维生素等。
(2)A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊（如图），表明 。
(3)为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样 后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现 。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
(4)为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证（主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱）
。
【答案】
(1)氮源、碳源
(2)A菌能在培养平板中生长繁殖
(3) 稀释 溶菌圈
(4)假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂
【分析】微生物的营养成分主要有碳源、氮源、水和无机盐等。微生物的培养基按其特殊用途可分为选择性培养基和鉴别培养基，培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。
【详解】
（1）蛋白胨主要为细菌提供氮源、碳源和维生素等。
（2）将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊，表明A菌能在培养平板中生长繁殖。
（3）将含菌量较高的湖泊水样稀释后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。　
（4）根据实验实验材料和设备，圆形滤纸小片可用于吸收某种物质，离心机可用于分离菌体和细菌分泌物，为探究P菌溶解破坏A菌的方式，可假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂。
2．（2023·重庆·高考真题）妊娠与子宫内膜基质细胞的功能密切相关。某研究小组通过如图所示的实验流程获得了子宫内膜基质细胞，以期用于妊娠相关疾病的研究。

(1)手术获得的皮肤组织需在低温下运至实验室，低温对细胞中各种蛋白质的作用为 。
(2)过程①中，诱导形成PS细胞时，需提高成纤维细胞中4个基因的表达量，可采用 技术将这些基因导入该细胞。这4个基因的主要作用为：M基因促进增殖，S基因和C基因控制干细胞特性，K基因抑制凋亡和衰老。若成纤维细胞形成肿瘤细胞，最有可能的原因是 基因过量表达。
(3)培养iPS细胞时，应对所处环境定期消毒以降低细胞被污染风险。可用紫外线进行消毒的是_ ____（多选）。
A．培养基 B．培养瓶 C．细胞培养室 D．CO2培养箱
(4)过程②中，iPS细胞经历的生命历程为 。PCR技术可用于检测子宫内膜基质细胞关键基因的mRNA水平，mRNA需经过 才能作为PCR扩增的模板。
【答案】
(1)抑制酶的活性（降低蛋白质或酶的活性），防止蛋白质变性
(2) 转基因 M
(3)CD
(4) 增殖分化 逆转录/反转录
【分析】
1、构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因。
2、动物细胞培养的条件：
（1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌；②添加一定量的抗生素；③定期更换培养液，以清除代谢废物。
（2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。
（3）温度和pH：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。
（4）气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH）。
【详解】
（1）低温可以抑制酶的活性，防止蛋白质变性，使细胞中的蛋白质维持正常的生理功能。
（2）将外源基因导入细胞内，通常需要转基因技术。即过程①中，诱导形成PS细胞时，需提高成纤维细胞中4个基因的表达量，可采用转基因技术将这些基因导入该细胞。M基因促进增殖，S基因和C基因控制干细胞特性，K基因抑制凋亡和衰老。肿瘤细胞（癌细胞）具有无限增殖的能力，因此若成纤维细胞形成肿瘤细胞，最有可能的原因是M基因过量表达造成的。
（3）培养iPS细胞时，应对所处环境定期消毒以降低细胞被污染风险。可用紫外线对细胞培养室和CO2培养箱进行消毒处理，而对培养基和培养瓶需要进行灭菌处理，因此AB错误，CD正确。
故选CD。
（4）由图可知，过程②中，iPS细胞经过细胞的分裂分化，即增殖分化，形成了体腔上皮。PCR扩增的模板为DNA，因此若想利用PCR技术检测子宫内膜基质细胞关键基因的mRNA水平，mRNA需经过逆转录过程形成DNA，才可作为PCR的模板。
3．（2023·天津·高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。

(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA基因进行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。

（ii）切去UGA基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。


【答案】
(1)细胞外
(2)P1和P6
(3) 缺乏尿嘧啶 方式二 含有5-氟乳清酸
(4)图3
【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
【详解】
（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。
（2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。
（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；
方式一，C和C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。
（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
（4）根据前面分析，C和C'的中间插入UGA，A和B之间插入的目的基因，所以图3正确。
4．（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。

(3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
【答案】
(1)A/腺嘌呤
(2) Q R
(3) 将Ce酶基因和Er基因连接 饲喂口服药T
(4)大多数B细胞没有被BrdU标记
【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。
【详解】
（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。
（2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。　
（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。
（4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的B细胞直接分裂，不会再有DNA复制过程，故t2时间后用BrdU饲喂则不起作用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。
5．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。

(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】
(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2 a链
(3) J-V5融合蛋白 不是
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】
（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。
6．（2023·浙江·高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生
，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
【答案】
(1) 负反馈调节 过量赖氨酸类似物
(2) 基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF
DNA酶
PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
【分析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。
（2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。
②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。
③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
7．（2023·全国·高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
。
【答案】
(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
(2) 筛选 RNA聚合酶
(3) 核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA片段
(4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质
【分析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。
RNA聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。
（3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。
基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
（4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基因是否转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原-抗体杂交技术。
8．（2023·湖南·高考真题）某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题：
(1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和 。
(2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好，若要确定其有抑菌效果的最低浓度，需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。
测试菌 抗菌肽浓度/（ g mL-1）
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
金黄色葡萄球菌 - - - - - + +
枯草芽孢杆菌 - - - - - + +
禾谷镰孢菌 - + + + + + +
假丝酵母 - + + + + + +
注：“+”表示长菌，“-”表示未长菌。
(3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体，转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 （答出两点即可）。
(4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体，如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 （答出两点）等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术 （填“是”或“否”）。

(5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种耐药菌，严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。
①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体 ②MRSA感染的肺类装配体 ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽 ④生理盐水 ⑤青霉素（抗金黄色葡萄球菌的药物） ⑥万古霉素（抗MRSA的药物）
【答案】
(1)无机盐、淀粉
(2) 金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 1.73~3.45
(3)淀粉酶编码基因M发生突变；重组质粒在大肠杆菌分裂过程中丢失
(4) 无菌、无毒环境，含95%空气和5%CO2的气体环境 否
(5)②③④⑥
【分析】动物培养的条件：
1、营养：在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。
2、无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作:定期更换培养液，以便清除代谢产物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
3、适宜温度、pH和渗透压：哺乳动物细胞培养的温度多为(36.5±0.5)℃；pH多为7.2~7.4；动物细胞培养还需要考虑渗透压。
4、气体环境：O2：细胞代谢所必需的；CO2：维持培养液pH。
【详解】
（1）由题意可知，根际促生菌具有固氮作用，可利用空气中的氮气作为氮源，因此用于筛选根际促生菌的培养基的主要营养物质包括水、无机盐和淀粉。
（2）由题表可知，在抗菌肽浓度为3.45-55.20 μg·mL-1范围内，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均不能生长，表明该抗菌肽对它们的抑菌效果较好；因为抗菌肽的浓度为1.73μg·mL-1时，它们均能生长，所以要确定抗菌肽抑菌效果的最低浓度，应在1.73~3.45 μg·mL-1的浓度区间进一步实验。
（3）在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M，可能的原因是淀粉酶编码基因M发生突变；或者是重组质粒在大肠杆菌分裂过程中丢失。
（4）肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及无菌、无毒环境，含95%空气和5%CO2的气体环境等基本条件；由图示可知，肺类装配体形成的过程中没有运用动物细胞融合技术，只涉及了细胞的分裂和分化等内容。
（5）科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力，必备实验材料为：②MRSA感染的肺类装配体、 ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽、④生理盐水（设置对照实验使用）、 ⑥万古霉素（抗MRSA的药物，比较解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽的疗效），故选②③④⑥。
9.（2022·湖南·高考真题）黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发酵酒的酿造过程中除了产生乙醇外，也产生不利于人体健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素与乙醇反应形成，各国对酒中的EC含量有严格的限量标准。回答下列问题:
(1)某黄酒酿制工艺流程如图所示，图中加入的菌种a是 ，工艺b是 （填“消毒”或“灭菌”），采用工艺b的目的是 。
(2)以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂，根据颜色变化，可以初步鉴定分解尿素的细菌。尿素分解菌产生的脲酶可用于降解黄酒中的尿素，脲酶固定化后稳定性和利用效率提高，固定化方法有 （答出两种即可）。
(3)研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌L，在不同条件下分批发酵生产脲酶，结果如图所示。推测 是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素，理由是 。
(4)某公司开发了一种新的黄酒产品，发现EC含量超标。简要写出利用微生物降低该黄酒中EC含量的思路 。
【答案】
(1) 酵母菌 消毒 杀死啤酒的中大多数微生物，并延长其保存期
(2) 酚红 化学结合法、包埋法、物理吸附法
(3) pH 两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，而维持pH在6.5不变与pH从6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高
(4)方案一：配置一种选择培养基，筛选出产生EC降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC降解酶，纯化的EC降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。方案二：配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。
【分析】由于细菌分解在尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，pH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，可在培养基中加入酚红指示剂，尿素被分解后产生氨，pH升高，指示剂变红。
【详解】（1）制造果酒利用的是酵母菌的无氧呼吸，加入的菌种a是酵母菌。过滤能除去啤酒中部分微生物，工艺b是消毒，目的是杀死啤酒的中大多数微生物，并延长其保存期。
（2）由于细菌分解尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，pH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，故在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可以鉴别尿素分解菌。固定化酶实质上是将相应酶固定在不溶于水的载体上，实现酶的反复利用，并提高酶稳定性，酶的各项特性（如高效性、专一性和作用条件的温和性）依然保持。固定化酶的方法包括化学结合法、包埋法、物理吸附法等。
（3）对比两坐标曲线，两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，说明培养时间不是决定因素；而维持pH在6.5不变与pH从6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高，说明pH为6.5时，有利于酶结构的稳定，故pH是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素。
（4）从坐标图形看，利用脲酶消除其前体物质尿素可降低该黄酒中EC含量。配置一种选择培养基，筛选出产生EC降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC降解酶，纯化的EC降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。或者配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。
10.（2023·湖北·高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。

回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和 生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。

【答案】
(1) 不需要
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2) 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】
（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。
故选④。
1.（2024·云南昭通·模拟预测）今年4月27日，大熊猫“丫丫”回国在社会上引起了巨大反响。自然状态下的大熊猫繁殖能力较低，曾一度濒临灭绝，我国科学家利用胚胎工程的技术手段大大提高了熊猫的繁殖率，目前我国的熊猫数量已经有2400余只。请回答下列问题：
(1)大熊猫主要以竹子为食，研究人员为了从大熊猫粪便中筛选出纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以 为唯一碳源的固体培养基上进行培养。配制的培养基可用 方法进行灭菌处理。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是 。
(2)大熊猫体内受精受孕率低，可利用体外受精。受精前需要对采集的精子进行 处理，收集的卵母细胞要培养至 期。
(3)为了进一步提高熊猫的产子率，科学家用了胚胎分割技术，该技术属于 （填“有性”或“无性”）生殖，进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的 。胚胎移植前有时需进行性别鉴定，目前SRY-PCR技术是哺乳动物性别鉴定最有效的方法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取 细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基序列作为 ，用被测胚胎DNA作模板进行PCR扩增，若通过鉴定，出现阳性反应的胚胎为雄性。
【答案】
(1) 纤维素 高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） 将灭菌后的空白培养基（与接种过的培养基），放在相同且适宜的条件下培养，培养后若空白培养基没有产生菌落，则说明培养基灭菌彻底
(2) 获能 MⅡ（期）
(3) 无性 桑葚胚或囊胚 滋养层 引物
【分析】分解纤维素的微生物分离的实验原理：
土壤中存在着大量纤维素分解酶，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，可以把纤维素分解为纤维二糖，进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用，故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长；
（2）在培养基中加 入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。
【详解】
（1）在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。 为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养；配制培养基的常用高压蒸汽灭菌，即将培养基置于压力100kPa、温度121℃条件下维持15~30分钟，目的是为了杀死培养基中的所有微生物(微生物和芽孢、孢子)。为检测灭菌效果可对培养基进行空白培养，即将未接种的培养基在放在相同且适宜的条件下培养，若在适宜条件下培养无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。
（2）采集的精子要进行获能处理，才能用于体外受精，收集的卵母细胞要培养至MII期才能用于体外受精。
（3）胚胎分割技术用一个胚胎培育出多个后代，不经受精作用属于无性生殖；胚胎分割要在发育程度较低的桑椹胚或囊胚时期进行。胚胎性别鉴定操作的基本程序是从被测的囊胚中取滋养层细胞，提取DNA，取滋养层细胞不会影响到内细胞团；Y染色体上的性别决定基因(即SRY基因)的一段碱基序列设计引物，用被测胚胎DNA作模板进行PCR扩增；若存在Y染色体，则存在SRY基因，PCR是体外进行DNA复制，因此能扩增出相应的条带，电泳能检测到相应的基因。
2．（2024·河南开封·二模）苹果不仅味道香甜，还具有很高的营养价值。用苹果发酵的果酒具有加速新陈代谢、活血通络、通便减肥等多种作用。图1为简易的发酵瓶，图2为细胞呼吸的相关代谢途径。请回答下列问题。
(1)从微生物培养的角度看，作为培养基的苹果汁能够为酵母菌提供的营养物质有 。
(2)将苹果汁、酵母菌等原料装入图1所示发酵瓶，然后塞好瓶塞，夹紧进气管和出气管，在适宜的温度条件下静置。该过程中，发酵瓶内酵母菌可进行图2中的 （选填编号）过程。
(3)请在坐标图中，绘制酿造苹果酒的过程中发酵瓶内酵母菌的种群数量变化曲线（绘出变化趋势即可） 。酵母菌的数量测定可以用稀释涂布平板法进行，其中使酵母菌液在培养基表面均匀分布的操作是 。也可以用 计数板对酵母菌进行计数。
(4)若将酿好的苹果酒置于30～35℃温度条件下，将发酵瓶的进气管、出气管分别 ，再加入适量的醋酸菌，一段时间后酒味会逐渐消失并出现醋酸味，苹果酒逐渐转变为苹果醋。其主要原因是 。
(5)若在制作苹果酒之前，打开图1中进气管、出气管一段时间，其意图与发酵工程基本环节中的
目的一致。
【答案】
(1)碳源、氮源、无机盐、水
(2)①②③
(3) 转动培养皿，使用涂布器均匀涂布 血细胞
(4) 打开 在氧气充足的条件下，醋酸菌有氧发酵将乙醇转变成醋酸
(5)扩大培养
【分析】
1、参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。果酒制作的原理：无氧呼吸产生酒精。
2、参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的果糖分解成醋酸。当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
【详解】
（1）从微生物培养的角度看，作为培养基的苹果汁能够为酵母菌提供的营养物质有碳源、氮源、无机盐、水。
（2）将苹果汁、酵母菌等原料装入图1所示发酵瓶，然后塞好瓶塞，夹紧进气管和出气管，在适宜的温度条件下静置。发酵瓶内保留有一部分空气，刚开始酵母菌进行有氧呼吸，可以进行图中①②阶段，氧气耗尽后进行无氧呼吸，可以进行①③阶段，总结起来，该过程中，发酵瓶内酵母菌可进行图2中的①②③过程。
（3）刚开始发酵瓶内营养物质充足，随着发酵过程不断进行，种群数量增加，竞争加剧，种群数量呈现S形增长，一段时间后营养物质耗尽，种群数量下降，发酵瓶内酵母菌的种群数量变化曲线如图：
酵母菌的数量测定可以用稀释涂布平板法进行，其中使酵母菌液在培养基表面均

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