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微专题11 PCR技术与电泳相关问题
【知识必备】
题型一　PCR技术的相关计算
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
2.PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的数量 1 3 7 2n－1
同时含两种引物的数量 0 2 6 2n－2
共消耗引物的数量 2 6 14 2n＋1－2
[典例1] （2024·河北石家庄统考）实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（　　）
A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D.病毒的检测还可以检测病毒引发产生的抗体，其原理是抗原—抗体杂交
题型二　PCR定点突变技术——重叠延伸PCR
1.图解
2.四种引物
引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。
3.流程
（1）分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起。
（2）再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。
（3）用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。
（4）通过测序可以检验定点突变是否成功。
[典例2] （2024·山东淄博模拟）定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：
（1）利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2），在PCR1中，至少需要　　　　个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的　　　　（填“①”或“②”）。
（2）为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
为将改良基因构建在质粒上，还需要　　　　等酶。
（3）在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述组件的溶液加入大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和　　　　的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
题型三　DNA片段电泳与遗传试题的综合
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团带有正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。不同大小的DNA片段迁移速率不同，凝胶中的DNA分子通过染色可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。因此琼脂糖凝胶电泳能够用于分离、鉴定和纯化DNA片段。等位基因由基因突变而来，若一对等位基因A、a经过限制酶切割后形成的DNA片段分子量不同，则在电场作用下移动距离不同，最终使得A、a得以分开，形成不同的条带。
[典例3] （2024·辽宁辽阳模拟）生菜的颜色受两对等位基因A/a和B/b控制。野生生菜通常表现为红色，人工栽培的生菜品种均表现为绿色。让某纯合野生型红色生菜植株与人工栽培的绿色生菜植株杂交，所得F1再自交，F2中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为9∶7。育种工作者根据A/a和B/b的基因序列设计了特异性引物，并分别对F2中编号为1～8的部分红色生菜植株的DNA进行扩增和分离，结果如图所示。下列分析错误的是（　　）
A.杂交亲本的基因型是AABB和aabb
B.由植株1～8的DNA扩增和分离结果可知，F2红色生菜植株中基因A/a杂合的概率高于基因B/b的
C.野生生菜的性状是由两种显性基因共同决定的
D.植株1～8中的杂合子占3/4，但杂合子的基因型不一定相同
：课后完成　热点练11微专题11 PCR技术与电泳相关问题
【知识必备】
题型一　PCR技术的相关计算
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
2.PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的数量 1 3 7 2n－1
同时含两种引物的数量 0 2 6 2n－2
共消耗引物的数量 2 6 14 2n＋1－2
[典例1] (2024·河北石家庄统考)实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是(　　)
A.做RT-PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D.病毒的检测还可以检测病毒引发产生的抗体，其原理是抗原—抗体杂交
答案　C
解析　PCR需要根据cDNA的核苷酸序列合成引物，同时RT—PCR还需要探针与待测样本DNA混合，故需要根据cDNA的核苷酸序列合成探针，A正确；PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误；RNA病毒的检测方法有：①RNA检测，即检测病毒的遗传物质RNA；②特异性抗原蛋白检测，即检测病毒表面的一种糖蛋白；③特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体，后两种方法的原理是抗原—抗体杂交，D正确。
题型二　PCR定点突变技术——重叠延伸PCR
1.图解
2.四种引物
引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。
3.流程
(1)分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起。
(2)再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。
(3)用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。
(4)通过测序可以检验定点突变是否成功。
[典例2] (2024·山东淄博模拟)定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：
(1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要　　　　个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的　　　　(填“①”或“②”)。
(2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是_____________________________________________________________
____________________________________________________________________。
为将改良基因构建在质粒上，还需要　　　　等酶。
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述组件的溶液加入大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和　　　　的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是_________________
____________________________________________________________________。
答案　(1)2　②　(2)SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接　BglⅡ、DNA连接酶　(3)β-半乳糖苷　构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能分解β-半乳糖苷产生蓝色物质，菌落为白色
解析　(1)由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到的DNA有一个不含突变位点，另一个DNA有一条链含有突变位点，进行第二轮循环，即可得到DNA有两个不含突变位点、一个含一个突变位点和一个两条链均含突变位点的DNA，即大引物，所以至少需要经过两个循环才能获得相应的大引物模板；在PCR2中，由于DNA聚合酶只能从子链的3′端连接单个脱氧核苷酸，因此从大引物和目的基因的结合位点分析，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。(2)根据SmaⅠ的酶切位点，如果选择SmaⅠ，则获得的是平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接；从各种限制酶的酶切位点分析，除使用XmaⅠ外，还需使用BglⅡ切出相应黏性末端与改良基因CTAG一侧进行连接，同时需要用DNA连接酶构建基因表达载体。(3)因LacZ基因编码的酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，如果没有分解，则菌落为白色，因此可以将菌液涂布在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上，由于重组质粒的LacZ基因在重组过程中被切断，不能编码相应的酶分解β-半乳糖苷，呈现白色，因此白色菌落含有重组质粒。
题型三　DNA片段电泳与遗传试题的综合
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团带有正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。不同大小的DNA片段迁移速率不同，凝胶中的DNA分子通过染色可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。因此琼脂糖凝胶电泳能够用于分离、鉴定和纯化DNA片段。等位基因由基因突变而来，若一对等位基因A、a经过限制酶切割后形成的DNA片段分子量不同，则在电场作用下移动距离不同，最终使得A、a得以分开，形成不同的条带。
[典例3] (2024·辽宁辽阳模拟)生菜的颜色受两对等位基因A/a和B/b控制。野生生菜通常表现为红色，人工栽培的生菜品种均表现为绿色。让某纯合野生型红色生菜植株与人工栽培的绿色生菜植株杂交，所得F1再自交，F2中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为9∶7。育种工作者根据A/a和B/b的基因序列设计了特异性引物，并分别对F2中编号为1～8的部分红色生菜植株的DNA进行扩增和分离，结果如图所示。下列分析错误的是(　　)
A.杂交亲本的基因型是AABB和aabb
B.由植株1～8的DNA扩增和分离结果可知，F2红色生菜植株中基因A/a杂合的概率高于基因B/b的
C.野生生菜的性状是由两种显性基因共同决定的
D.植株1～8中的杂合子占3/4，但杂合子的基因型不一定相同
答案　B
解析　F1自交，F2中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为9∶7，说明红色生菜基因型为A_B_，F1基因型为AaBb。由图可知，植株3、5的A/a、B/b的基因扩增结果都只有一条带，可知3、5为纯合子。杂交亲本的基因型为AABB和aabb时，满足亲本性状为红色和绿色，F1基因型为AaBb，A正确；F2红色植株的基因型为A_B_，所以A/a基因杂合的概率等于B/b，B错误；F2中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为9(A_B_)∶7，野生生菜通常表现为红色，因此野生生菜的性状是由两种显性基因共同决定的，C正确；植株1～8中，除3、5是纯合子外，其余均是杂合子，杂合子占3/4，由图DNA扩增和分离的条带分布可知杂合子基因型不一定相同，D正确。(共17张PPT)
微专题11
pcr技术与电泳相关问题
题型一　PCR技术的相关计算
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
2.PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的数量 1 3 7 2n－1
同时含两种引物的数量 0 2 6 2n－2
共消耗引物的数量 2 6 14 2n＋1－2
[典例1] (2024·河北石家庄统考)实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是(　　)
C
A.做RT-PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D.病毒的检测还可以检测病毒引发产生的抗体，其原理是抗原—抗体杂交
解析　PCR需要根据cDNA的核苷酸序列合成引物，同时RT—PCR还需要探针与待测样本DNA混合，故需要根据cDNA的核苷酸序列合成探针，A正确；PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误；RNA病毒的检测方法有：①RNA检测，即检测病毒的遗传物质RNA；②特异性抗原蛋白检测，即检测病毒表面的一种糖蛋白；③特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体，后两种方法的原理是抗原—抗体杂交，D正确。
题型二　PCR定点突变技术——重叠延伸PCR
1.图解
2.四种引物
引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。
3.流程
(1)分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起。
(2)再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。
(3)用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。
(4)通过测序可以检验定点突变是否成功。
[典例2] (2024·山东淄博模拟)定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：
(1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要　　　　个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的　　　　(填“①”或“②”)。
(2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是_____________________________________________________________。
为将改良基因构建在质粒上，还需要　　　　　　　　　　等酶。
2
②
SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接
BglⅡ、DNA连接酶
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述组件的溶液加入大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和　　　　　　　的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
β－半乳糖苷
构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能分解β-半乳糖苷产生蓝色物质，菌落为白色
解析　(1)由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到的DNA有一个不含突变位点，另一个DNA有一条链含有突变位点，进行第二轮循环，即可得到DNA有两个不含突变位点、一个含一个突变位点和一个两条链均含突变位点的DNA，即大引物，所以至少需要经过两个循环才能获得相应的大引物模板；在PCR2中，由于DNA聚合酶只能从子链的3′端连接单个脱氧核苷酸，因此从大引物和目的基因的结合位点分析，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。(2)根据SmaⅠ的酶切位点，如果选择SmaⅠ，则获得的是平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接；从各种限制酶的酶切位点分析，除使用XmaⅠ外，还需使用BglⅡ切出相应黏性末端与改良基因CTAG一侧进行连接，同时需要用DNA连接酶构建基因表达载体。(3)因LacZ基因编码的酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，如果没有分解，则菌落为白色，因此可以将菌液涂布在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上，由于重组质粒的LacZ基因在重组过程中被切断，不能编码相应的酶分解β-半乳糖苷，呈现白色，因此白色菌落含有重组质粒。
题型三　DNA片段电泳与遗传试题的综合
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团带有正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。不同大小的DNA片段迁移速率不同，凝胶中的DNA分子通过染色可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。因此琼脂糖凝胶电泳能够用于分离、鉴定和纯化DNA片段。等位基因由基因突变而来，若一对等位基因A、a经过限制酶切割后形成的DNA片段分子量不同，则在电场作用下移动距离不同，最终使得A、a得以分开，形成不同的条带。
[典例3] (2024·辽宁辽阳模拟)生菜的颜色受两对等位基因A/a和B/b控制。野生生菜通常表现为红色，人工栽培的生菜品种均表现为绿色。让某纯合野生型红色生菜植株与人工栽培的绿色生菜植株杂交，所得F1再自交，F2中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为9∶7。育种工作者根据A/a和B/b的基因序列设计了特异性引物，并分别对F2中编号为1～8的部分红色生菜植株的DNA进行扩增和分离，结果如图所示。下列分析错误的是(　　)
B
A.杂交亲本的基因型是AABB和aabb
B.由植株1～8的DNA扩增和分离结果可知，F2红色生菜植株中基因A/a杂合的概率高于基因B/b的
C.野生生菜的性状是由两种显性基因共同决定的
D.植株1～8中的杂合子占3/4，但杂合子的基因型不一定相同
解析　F1自交，F2中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为9∶7，说明红色生菜基因型为A_B_，F1基因型为AaBb。由图可知，植株3、5的A/a、B/b的基因扩增结果都只有一条带，可知3、5为纯合子。杂交亲本的基因型为AABB和aabb时，满足亲本性状为红色和绿色，F1基因型为AaBb，A正确；F2红色植株的基因型为A_B_，所以A/a基因杂合的概率等于B/b，B错误；F2中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为9(A_B_)∶7，野生生菜通常表现为红色，因此野生生菜的性状是由两种显性基因共同决定的，C正确；植株1～8中，除3、5是纯合子外，其余均是杂合子，杂合子占3/4，由图DNA扩增和分离的条带分布可知杂合子基因型不一定相同，D正确。
本节内容结束
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