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第一章 发酵工程
——高二生物学人教版（2019）期末复习知识大盘点
第一部分：学习目标整合
1.
简述传统发酵技术的特点及常见应用。
2.
概述微生物纯培养的技术，阐明微生物选择培养和分离、计数
3.
概述发酵工程及其基本环节举例说明发酵工程的应用价值
第二部分：教材习题变式
【教材课后习题】
1.某化工厂为了处理排出污水中的一种有害的、难以降解的有机化合物A，其研究团队用化合物A、磷酸盐、镁盐和微量元素等配制了培养基，成功地筛选出能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如下图所示，请分析回答问题。
（1）在培养基中加入化合物A的目的是_____，这种培养基属于_____培养基。
（2）培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量_____的培养液，接入新的培养液中连续培养，使目的菌的数量_____。
（3）若要研究目的菌的生长规律，可挑取单个菌落进行液体培养，再采用_____方法进行计数。请你预测目的菌的种群数量会发生怎样的变化。
（4）将目的菌用于环境保护实践时，还有哪些问题需要解决？
（5）有人提出，可以通过改造细菌的基因来获得能够降解化合物A的细菌，请分析这种方法是否可行。
2.某个高温日，某校三位高中学生相约去吃冰激凌，之后两人都出现腹泻现象，于是他们怀疑冰激凌中的大肠杆菌含量超标。老师建议他们利用学过的有关微生物培养的知识对此冰激凌进行检测。经过一番资料查阅，他们提出了如下实验设计思路。
立即去卖冰激凌的小店再买一个同样品牌的同种冰激凌；配制伊红—亚甲蓝琼脂培养基（该培养基可用来鉴别大肠杆菌，生长在此培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色，并有金属光泽）、灭菌、倒平板；取10mL刚融化的冰激凌作为原液，然后进行梯度稀释，稀释倍数为1×10~1×105取每个浓度的冰激凌液各0.1mL，用涂布平板法进行接种，每个浓度涂3个平板，一共培养18个平板；在适宜温度下培养48h，统计菌落数目。
（1）请你从下面几个角度对这三位同学的思路进行评议。
①他们只打算对一个冰激凌进行检测，理由是：两个人吃过冰激凌后，都拉肚子了，所以再检测一个就足以说明问题。你同意这样的观点吗？为什么？
②有没有必要对冰激凌原液进行梯度稀释？为什么？【提示：我国卫生部门规定了饮用水标准，1mL自来水中细菌总数不可以超过100个（37℃培养24h），1000mL自来水中大肠杆菌菌落数不能超过3个（37℃培养48h）】
③他们认为，在用该方法统计菌落数目时不需要设计对照组，所以只准备培养18个平板。你认为在这项检测中是否需要对照组？为什么？
（2）下图所示为4种菌落分布图，一般不能由涂布平板法得到的是____。
（3）在完善实验设计思路后，三位同学进行了实验。培养结果显示，除了深紫色菌落，还有其他菌落存在，这说明了什么？如果以菌落数代表样品中的大肠杆菌数量，则统计结果比实际值是偏多还是偏少？为什么？
（4）如果实验结果显示，检测的冰激凌中大肠杆菌含量超标了。接下来他们应该做什么？
1.答案：（1）筛选出能降解化合物A的细菌选择
（2）低；增多
（3）稀释涂布平板：培养液中目的菌的种群数量在开始一段时间范围内，由于营养充分、空间充裕，种群数量类似于“J”形增长，随着营养物质的消耗，种群增长速率逐渐下降，最终会达到K值，继续培养，由于营养物质缺乏、有害代谢物积累、pH改变等，种群数量将会下降。
（4）将目的菌用于环境保护实践之前，还要对目的菌进行研究，检测其是否会产生对环境有害的代谢物；当使用大量目的菌时会不会使目的菌成为优势菌群，对其他微生物的生存构成威胁，从而打破微生物菌群的平衡等。
（5）可以利用基因工程的方法，将能降解化合物A的基因导入受体菌中来实现。但在使用之前要检验其安全性。
2.答案：（1）①不同意。对一个冰激凌进行检测，没有遵循实验的平行重复原则，实验误差可能会很大。
②有必要。若不进行梯度稀释，可能会由于菌体数量过多，两个或多个细菌连在一起当作一个菌落计数，从而使计数结果偏低。
③需要设计对照组，需要设计未接种的培养基作为空白对照，来检测培养基灭菌是否彻底。
（2）B
（3）说明冰激凌中除了大肠杆菌外，还有其他细菌等微生物的污染。若以菌落数代表样品中的大肠杆菌数量，则统计结果比实际值偏小，因为当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（4）如果大肠杆菌含量超标，应该向卫生检疫部门反映，停止售卖该种冰激凌，同时检测是冰激凌生产过程中大肠杆菌污染超标，还是水源中大肠杆菌污染超标。若是前者，冰激凌生产厂家应停止生产，进行设备灭菌等，直到达标；若是后者，应找到水源所在处，进行水源污染治理。
【变式训练】
1.研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
回答下列问题：
（1）研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用________________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________________为碳源时生长状况最好。
（2）研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是________________。（答一点即可）
（3）藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是________________。
（4）深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有________________。
2.部分白酒厂的常见白酒酿造工艺流程可简化为图1。浓发酵是指在高浓度的原料中发酵，在规模化生产中，发酵原料浓度的提高能增加生产能力，并具有降低能耗、节约水资源等优点。研究者不断探索能进一步提高发酵原料浓度的发酵工艺，以实现真正意义上的“浓”发酵。回答下列问题：

（1）玉米是东北地区酿制白酒的常用原料，作为培养基的主料主要提供酵母菌所需的碳源。玉米经碾磨后，在“拌料”环节中，除加水外，还应加入其他类型的营养物质如____________、____________以满足酵母菌的代谢需求，提高发酵效率。
(2)“蒸煮”可以改变淀粉分子结构，有利于淀粉的分解，此外，蒸煮还具有____________的作用
(3)“糖化”环节可以加入黑曲霉菌等菌种，也可以直接加入酶，该环节的目的是____________。
（4）发酵原料浓度升高，提高了发酵难度，常导致酒精转化效率降低，研究者对此展开了模拟实验：对照组一次性添加27g/mL浓度的葡萄糖，实验组在酒精发酵的前24h内分批次每3h添加3g/mL浓度的葡萄糖，最终保持两组添加的葡萄糖量相等，定期抽样检测，测定各组葡萄糖、酒精浓度。实验数据如图2所示。

①结果表明，在葡萄糖供应量相等的条件下，分批次添加能提高发酵效率，使酒精产量提高，从培养基理化性质的角度分析，一次性添加过多葡萄糖不利于酒精发酵的原因可能与____________有关。
②为实现浓醪发酵并提高产量，研究者提出了优化发酵工艺环节的建议：将玉米粒研磨颗粒适当增大、将糖化环节与发酵环节合并为一个环节。根据上述实验结果分析，这些措施能____________，从而在原料浓度高的情况下提高酒精产量。
1.答案：（1）高压蒸汽灭菌；平板划线；纤维素
（2）某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活）
（3）拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行
（4）耐低温
解析：（1）培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析图12可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。
（2）深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活），故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。
（3）拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。
（4）深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。
2.答案：（1）氮源；无机盐
（2）使原料在高温下灭菌
（3）使淀粉水解成葡萄糖，为酵母菌发酵提供底物
（4）液体培养基渗透压过高；降低淀粉的水解速度，边糖化边发酵，相当于分批补料，使培养液的渗透压不至于太高，有利于发酵
解析：（1）酵母菌代谢时需要水、碳源、氮源及无机盐，因此，酿制白酒时，降低了玉米提供碳源，添加了水外，还要添加氮源和无机盐，以满足酵母菌的代谢需求，提高发酵效率。
（2）蒸煮是指利用高温促进粮食淀粉颗粒吸水、膨胀、破裂，使淀粉膨胀成溶解状态，可以改变淀粉分子结构，有利于淀粉的分解。由于此过程利用了高温，因此蒸煮还具有灭菌的作用。
（3）“糖化”是指淀粉水解成葡萄糖的过程，黑曲霉菌在生活过程中会分泌淀粉酶，因此，“糖化”环节加入黑曲霉菌等菌种，或直接加入酶，都是为了把原料中的淀粉水解成葡萄糖，为酵母菌发酵提供底物。
（4）①酿酒时使用的培养基是液体培养基，据图2可知，一次性添加过多葡萄糖时，培养基中葡萄糖浓度很高，使培养基的渗透压也高。这会导致酵母菌吸水减少而影响代谢过程，或者会导致部分酵母菌失水死亡，进而不利于酒精发酵。
②将玉米粒研磨颗粒适当增大，则玉米中淀粉与淀粉酶接触概率减小，降低淀粉的水解速度，进而降低发酵液中葡萄糖浓度。将糖化环节与发酵环节合并为一个环节，边糖化边发酵相当于分批补料，使培养液的渗透压不至于太高，有利于发酵。
第三部分：重难知识易混易错
一、传统发酵技术
1.发酵：利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程
2.实例：腐乳制作
（1）参与微生物：毛霉、酵母、曲霉等
（2）原理：豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸，味道鲜美，易于消化吸收
3.传统发酵技术
（1）概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术
（2）形式：以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的
（3）产物：腐乳、酱油、醋、泡菜、豆豉、酱等
【例】千百年来，腐乳一直受到人们的喜爱。腐乳以黄豆为主要原料制成，它的制作与发酵技术密切相关。下列叙述错误的是（???）
A.腌制腐乳的过程中不需要严格进行灭菌处理
B.多种微生物参与了腐乳的制作，如酵母菌、毛霉和曲霉等
C.腐乳味道鲜美、易于消化，这与微生物发酵产生的小分子物质有关
D.微生物产生的脂肪酶能将豆腐中的脂肪分解为甘油和氨基酸
答案：D
解析：腐乳是利用微生物发酵制作的大豆食品，如果严格灭菌会抑制发酵，A正确；酵母菌、毛霉和曲霉等都参与了腐乳的制作，其中起主要作用的是毛霉，B正确；毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸，所以腐乳味道鲜美，易于消化吸收，C正确，D错误。
二、尝试制作传统发酵食品
1.泡菜制作的原理
（1）菌种：乳酸菌。
a.分布：广泛分布在空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道等处。
b.代谢类型：异养厌氧型。
c.常见种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌。其中乳酸杆菌常用于生产酸奶。
（2）发酵原理：乳酸菌在无氧条件下，将葡萄糖分解为乳酸。
2.泡菜制作的实验设计
a.制作流程
b.准备材料
①选择泡菜坛：选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
②选择原料：质地鲜嫩，肉丰富，无虫咬，无烂痕，无斑点。
c.制作过程
①原料处理：将鲜菜修整、清洗、阳光下晾晒到菜表皮萎蔫时收起，切成条状或片状。
②配制盐水：按照清水与盐的质量比为4∶1的比例配制盐水，并将盐水煮沸冷却。
③装坛：将经过预处理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛中，装至半坛时放入香辛料，继续装到八成满，再徐徐注入配制好的盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。
④封坛发酵：向坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。要注意经常补充水槽中的水。
⑤成品：将封好的坛子，放在室温环境中约15天，便可制成清脆爽口的泡菜。
d.腌制条件
在腌制过程中，要控制腌制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。
3.果醋和果酒的制作原理
（1）果酒的制作原理
a.菌种：酵母菌。
①代谢类型：兼性厌氧型。
②最适生长温度：20℃左右。
b.发酵原理：
①在有氧条件下，进行有氧呼吸，大量繁殖。
反应式：C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O。
②在无氧条件下，进行酒精发酵，产生酒精。
反应式：C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2。
c.菌种来源：自然发酵过程中，来源于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。
（2）果醋的制作原理
a.菌种：醋酸菌。
①代谢类型：需氧型。
②最适生长温度：30～35_℃。
b.发酵原理：
①当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。
②当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
反应简式：C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O。
4.果醋和果酒的制作流程
（1）实验流程
（2）实验装置
①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气；
②排气口：排出酒精发酵时产生的CO2；
③出料口：用来取样。
（3）发酵条件
果酒制作
果醋制作
温度
18～25℃
30～35℃
时间
10～12d
7～8d
通气
先通气后密封，或预留约1/3的空间
始终通气
（4）操作要求
a.器具的清洗、消毒：榨汁机要洗净晾干，发酵瓶要清洗干净并用体积分数为70%的酒精消毒。
b.材料的选择和处理：选择新鲜的葡萄，先用清水冲洗1～2遍除去污物后，再去枝梗。
c.榨汁装瓶：将冲洗干净并除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁，然后将葡萄汁装入发酵瓶，要留大约1/3的空间，并封闭充气口。
d.发酵：
①制葡萄酒的过程中，将温度严格控制在18～25℃，时间控制在10～12d，每天定时排出发酵产生的CO2，10d后开始从出料口抽样，监测酒精浓度或菌体数量。
②制葡萄醋的过程中，用充气泵不断从充气口泵入空气，温度严格控制在30～35℃，发酵7～8d，即可制成果醋。
（5）酒精检测
a.检测试剂：重铬酸钾。
b.检测条件：酸性条件。
c.实验现象：呈现灰绿色。
【例】图甲为果酒和果醋生产工艺流程简图，图乙为果酒、果醋发酵装置示意图。下列相关叙述错误的是（ ）
A.在葡萄冲洗后才能去除葡萄枝梗，以防止杂菌污染
B.尽量缩短排气口胶管的长度，以便顺利排出发酵产生的气体
C.发酵过程要控制适宜的温度，醋酸发酵的温度比酒精发酵的高
D.利用酵母菌进行酒精发酵时，充气口应该先打开后关闭
答案：B
解析：葡萄在冲洗后再去除葡萄枝梗，能防止杂菌污染，A正确；排气口有长长的胶管，其作用是排气，同时能避免杂菌污染，若发酵装置的排气口胶管过短。外界空气中的细菌容易进入发酵瓶，可能会导致污染，B错误；酒精发酵的最适温度在18～25℃之间，醋酸发酵最适温度在30～35℃之间，显然，醋酸发酵的温度比酒精发酵的高，C正确；利用酵母菌进行酒精发酵时，充气口先打开的目的是让酵母菌在有氧条件下大量繁殖，随后关闭充气口制造无氧环境进行酒精发酵，D正确。
三、发酵工程
1.发酵工程的含义
利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
2.发酵工程与传统发酵技术相比的特点
主要以可再生资源为原料；反应条件温和；环境污染较少；能生产目前不能生产或通过化学方法生产困难的性能优异的产品；投资较少。
3.发酵工程的基本环节
（1）菌种的选育（诱变育种、基因工程和细胞工程）
（2）扩大培养
（3）培养基的配制
（4）培养基和设备的灭菌
（5）接种（注意防止杂菌的污染，发酵罐冷却后才可加入）
（6）发酵罐内发酵——中心环节，需严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
（7）产品的分离和提纯
菌体可采用过滤、沉淀等方法分离。
代谢产物可采用蒸馏、萃取、离子交换等方法提取。
4.发酵工程中菌种的选择
（1）如果生产的是微生物直接合成的产物：可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。
（2）如果生产的是一般微生物不能合成的产品：可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传特性进行定向改造，以构建工程细胞或工程菌，从而达到生产相应产品的目的。
5.发酵工程的特点
（1）生产条件温和：温度、压力都不高。
（2）原料来源丰富且价格低廉：微生物种类多，易分离。
（3）产物专一：可直接生产某种物质。
（4）废弃物对环境的污染小且容易处理：废料是各种代谢产物，只要灭菌后，一般对环境不造成污染。
6.发酵工程的应用
（1）在食品工业上的应用
生产传统的发酵产品，如酱油、各种酒类。
生产各种各样的食品添加剂，如通过黑曲霉发酵制得的柠檬酸，由谷氨酸棒状杆菌发酵生产味精。
生产酶制剂，如α淀粉酶、β淀粉酶、脂肪酶等。
（2）在医药工业上的应用
基因工程、蛋白质工程等的广泛应用给发酵工程制药领域的发展注入了强劲动力。
（3）在农牧业上的应用
生产微生物肥料。微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长，常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。
生产微生物农药。微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。微生物农药作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用。
生产微生物饲料。微生物含有丰富的蛋白质。以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白，用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。
（4）在其他方面的应用
发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域，在助力解决粮食、环境、健康和能源等方面的重大问题上，作出了越来越大的贡献。
【例】谷氨酸除用于制造味精外，还可以用来治疗神经衰弱以及配制营养注射液等。通过发酵工程可以大量制备谷氨酸，下列有关谷氨酸发酵生产的叙述，误（是( )
A.发酵之前要对谷氨酸菌种进行扩大培养
B.若发酵产品是产谷氨酸菌种，可采用过滤等方法分离
C.发酵过程中，在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸
D.分离、提纯发酵产物是发酵过程的中心环节
答案：D
解析：
选项
解析
正、误
A项
发酵罐的体积很大，发酵之前要对谷氨酸菌种进行扩大培养
正确
B项
若发酵产品是产谷氨酸菌种，可采用过滤、沉淀等方法分离
正确
C项
发酵过程中在中性或弱碱性条件下会积累谷氨酸
正确
D项
发酵罐内的发酵是发酵过程的中心环节
错误
四、培养基的配制
1.培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
2.培养基的分类：按照物理性质不同分为两类。
（1）液体培养基：呈液体状态的培养基，不加入凝固剂（如琼脂）。
（2）固体培养基：呈固体状态的培养基，加入凝固剂（如琼脂）。
3.营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
4.培养基特殊需求：
（1）培养乳酸杆菌时，在培养基中添加维生素。
（2）培养霉菌时，将培养基调至酸性。
（3）培养细菌时，将培养基调至中性或弱碱性。
（4）培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
【例】下表为某培养基的配方，有关叙述正确的是（ ）
成分
牛肉膏
葡萄糖
K2HPO4
琼脂
蒸馏水
含量
10g
10g
2g
适量
定容至1000mL
A.从物理性质看，该培养基属于液体培养基
B.该培养基中属于氮源的物质有牛肉膏和葡萄糖
C.配制该培养基并调节pH后可直接接种微生物
D.该培养基可用于菌种的分离、计数、鉴定
答案：D
解析：不含凝固剂（如琼脂）、呈液体状态的培养基为液体培养基，呈固体状态的培养基为固体培养基，题表培养基配方中有琼脂，故该培养基为固体培养基，A错误；一切能满足微生物生长繁殖所需氮元素的营养源称为氮源，牛肉膏（内含蛋白质）含氮元素，属于氮源，葡萄糖不含氮元素，不能作氮源，B错误；按配方配制培养基，并调节培养基的pH后，需要进行灭菌处理，C错误；人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质一培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物，其中固体培养基常用于菌种的分离、计数、鉴定，D正确。
五、无菌技术
1.无菌技术关键：防止杂菌污染。
2.无菌技术的目的：
（1）可防止实验室的培养物被其他微生物污染。
（2）有效避免操作者自身被微生物感染。
3.无菌技术的选择原则：
（1）考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。
（2）考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。
4.消毒与灭菌：
（1）概念：
①消毒：使用较为温和的物理、化学或生物等方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
②灭菌：使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）。
（2）类型
消毒
灭菌
常用方法
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法
灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象
操作空间、操作者双手等
接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
【例】无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中错误的是（ ）
A.对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌
B.将用于微生物培养的培养皿、接种用具和培养基等进行灭菌
C.为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触
答案：A
解析：A、对实验操作的空间、操作者的衣着和手应进行消毒，A错误；B、为保证不被杂菌污染，应将培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌，B正确；C、酒精灯火焰附近可以形成一个无菌区，为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行，C正确；D、周围物品可能会含有杂菌，为防止污染，实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触，D正确。故选A。
六、微生物的纯培养
1.微生物纯培养的概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
2.酵母菌的纯培养：
（1）纯培养的原理：设法在培养基上得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物（单菌落）。
（2）纯培养方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
（3）纯培养过程：
a配制培养基：

b灭菌：培养基转移至锥形瓶，加棉塞，包上牛皮纸，如图所示，然后放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，培养皿包扎后放入干热灭菌箱内灭菌。

c倒平板：待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行。具体操作过程：

d平板划线法接种和分离酵母菌
①平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
②平板划线法结果：
平板划线示意图（A）及培养后菌落分布示意图（B）如下图所示。

③几次灼烧的目的：
灼烧时期
目的
第一次操作（取菌种前）
杀死接种环上原有的微生物，避免污染培养物
每次划线之前
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
划线结束
杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
（4）培养酵母菌：接种和未接种的平板在温度适宜的恒温箱中培养。
【例】为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员用被石油污染过的土壤进行如图A所示的实验。步骤④的一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。下列叙述错误的是（ ）
A.步骤③的培养基与普通液体培养基的最大区别是步骤③的培养基中石油是唯一碳源
B.步骤⑤振荡培养的目的是提高培养液溶氧量，同时使菌体与培养液充分接触
C.图B培养基的结果可能是涂布不均匀造成的
D.步骤⑤后取样测定石油含量的主要目的是筛选出能分解石油的细菌
答案：D
解析：该实验的目的是分离和纯化高效分解石油的细菌，因此步骤③的培养基与普通液体培养基的最大区别是步骤③的培养基中石油是唯一碳源，A正确；步骤⑤需要振荡培养，以提高培养液中（溶解）氧的含量，同时振荡可使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，B正确；步骤④采用的接种方法是稀释涂布平板法，出现图B结果（菌落分布不均匀）可能是涂布不均匀造成的，C正确；步骤⑤后取样测定石油含量的目的是筛选出分解石油能力最强的细菌，D错误。
七、微生物的选择培养与计数
1.选择培养基
（1）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
（2）选择培养基概念：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
（3）选择培养基配方的设计：
a原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生NH3。
b培养基配方设计：以尿素为唯一氮源的选择培养基。
2.微生物的选择培养
（1）方法：对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
（2）稀释涂布平板法的操作过程：
a系列梯度稀释操作：

b涂布平板操作。
①取菌液：取0.1mL菌液，添加到培养基表面。
②涂布器灭菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上燃烧，酒精燃尽后，冷却涂布器。
③涂布过程：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。
（3）培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱中培养，观察。
3.微生物的数量测定
（1）稀释涂布平板法
a统计依据。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
b操作。
①一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②选用一定稀释范围的样品液进行培养，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。
c注意问题：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（2）显微镜直接计数
a原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
b方法：显微镜下观察，细菌计数板或血细胞计数板计数。
c计算公式：
每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
d缺点：统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和，计算结果比实际值偏大。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）实验流程示意图：

（2）实验操作过程：
流程
具体操作
操作提示
土壤取样
先铲去表层土，取距地表 3～8?cm的土壤层，将样品装入纸袋中
①适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样
②取样用的铁铲和取样的纸袋使用前都需要灭菌
制备培养基
分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基
牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用
样品的稀释和涂布
①火焰旁称取土壤样本
②将稀释倍数为103～107的稀释液涂布平板。每个稀释度至少涂布三个平板作为重复组
①注意无菌操作
②对所用的平板、试管做好标记
③初次实验对于稀释的范围没有把握，可选择一个较为宽泛范围103～107倍的稀释液
培养、观察和计数
①将涂布好的平板和空白平板放在适宜温度下的培养箱中倒置培养
②每隔24?h统计一次菌落数目，比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录
③当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300 的平板进行计数
①空白平板作为对照，检测培养基制备是否合格
②观察时还要记录不同菌落的形状、大小、颜色等
③在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中活菌的数目
【例】常乳是指雌性哺乳动物产后14天后所分泌的乳汁。奶牛自身乳房和乳头中可能含有细菌，加上挤乳过程中产生的少量污染，因此常乳中会有一定量的细菌存在。研究小组要检测一份常乳样品中细菌的总量（不考虑菌种），检测流程如图，每个平板上接种菌液量为0.1mL。下列说法错误的是（ ）
A.倒平板时将培养皿打开一条细缝，不要完全打开，防止杂菌污染
B.上述方法是稀释涂布平板法，培养基要营养全面，适合各种细菌生长
C.也可以通过连续划线的方法接种，通过菌落数计算样品中的细菌总数
D.若三个平板上的菌落平均数为59个，则每毫升样品中细菌总数为5.9×107个
答案：C
解析：打开一条细缝是为了减少培养基与空气的接触，防止杂菌污染，A正确。对细菌进行计数常用稀释涂布平板法，B正确。平板划线法只能用于微生物的分离，不能用于计数，C错误。每毫升样品中细菌总数=（菌落平均数÷接种菌液量）×稀释倍数=59÷0.1×105=5.9×107（个），D正确。
第四部分：核心素养对接高考
本专题的考查内容集中在微生物的实验室培养、特定微生物数量的测定方法、发酵工程的应用以及特定发酵产物的制备。本专题内容贴近生产生活，是高考的命题热点。
【2023·湖南卷】1.某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题：
（1）若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和____。
（2）现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对_________________的抑制效果较好，若要确定其有抑菌效果的最低浓度，需在__________μg·mL-1浓度区间进一步实验。
测试菌
抗菌肽浓度/（?g·mL-1）

55.20
27.60
13.80
6.90
3.45
1.73
0.86
金黄色葡萄球菌
-
-
-
-
-
+
+
枯草芽孢杆菌
-
-
-
-
-
+
+
禾谷镰孢菌
-
+
+
+
+
+
+
假丝酵母
-
+
+
+
+
+
+
注：“+”表示长菌，“－”表示未长菌。
（3）研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体，转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是______（答出两点即可）。
（4）研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体，如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及_____（答出两点）等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术___（填“是”或“否”）。

（5）耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种耐药菌，严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是______。
①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体
②MRSA感染的肺类装配体
③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽
④生理盐水
⑤青霉素（抗金黄色葡萄球菌的药物）
⑥万古霉素（抗MRSA的药物）
【2023·山东卷】2.平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是（ ）
A.不含氮源的平板不能用于微生物培养
B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
【2023·1月浙江卷】3.某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是（ ）
A.培养基pH需偏碱性 B.泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
C.需在无氧条件下培养 D.分离得到的微生物均为乳酸菌
【2023·北京卷】4.自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
（1）用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供___________和维生素等。
（2）A菌通常被用作溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊（如图），表明______________________。

（3）为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样___________后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现___________。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
（4）为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证。
主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱。
【2023·山东卷】5.以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理：①沸盐水冷却后再倒入坛中；②盐水需要浸没全部菜料；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是（ ）
A.①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死
B.②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌
C.③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入
D.④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低
【2023·山东卷】6.果酒的家庭制作与啤酒的工业化生产相比，共同点有（ ）
A.都利用了酵母菌无氧呼吸产生酒精的原理
B.都需要一定的有氧环境供发酵菌种繁殖
C.发酵前都需要对原料进行灭菌
D.发酵结束后都必须进行消毒以延长保存期
1.答案：（1）无机盐、碳源
（2）金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌；1.73~3.45
（3）淀粉酶编码基因M发生突变；能产生淀粉酶M的个体产生后代时发生性状分离
（4）无菌、无毒环境，含95%O2和5%CO2的气体环境；否
（5）③④⑥
解析：（1）由题意可知，根际促生菌具有固氮作用，因此用于筛选根际促生菌的培养基的主要营养物质包括水、无机盐和碳源。
（2）由题表可知，在抗菌肽浓度为3.45～55.20mg·mL-1范围内，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均不能生长，表明该抗菌肽对它们的抑菌效果较好。因为抗菌肽的浓度为1.73mg·mL-1时，它们均能生长，所以要确定抗菌肽抑菌效果的最低浓度，应在1.73～3.45mg·mL-1浓度区间设置更小的浓度梯度进行实验。
（3）A菌株在传代过程中，淀粉酶编码基因M可能发生突变导致其不能产生淀粉酶M；或者在遗传过程中能产生淀粉酶M的个体产生后代时发生性状分离。
（4）动物细胞培养的条件除需要适宜的营养、温度、渗透压、pH外，还需要无菌、无毒环境以及含95%O2和5%CO2的气体环境。肺类装配体形成过程中涉及不同类型的细胞，但仅是将不同类型细胞组装起来，而非使不同类型的细胞融合。
（5）实验的目的是探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。因此自变量为是否使用解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽，因变量为MRSA引起的肺炎的症状是否缓解。所以实验组用解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽处理，实验对象为MRSA感染的肺炎装配体，另外用万古霉素（抗MRSA的药物）来检测解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽的抗菌效果。因此所选实验材料有②③⑥。
2.答案：D
解析：A、不含有氮源的平板可用来培养利用空气中氮气的微生物，A错误；B、平板涂布时涂抹器使用前必须进行灭菌处理，以防止外来杂菌的污染，B错误；C、接种后未长出菌落的培养基，也可能有少量微生物，所以不能直接丢弃，C错误；D、利用以尿素为唯一氮源的平板上，若微生物可以产生脲酶，则可以利用脲酶分解尿素氨而获得氮源生长，其他不能产生脲酶的微生物则不能生长，可以把合成脲酶的微生物分离出来，D正确。故选：D。
3.答案：C
解析：培养乳酸菌的培养基应偏酸性，A项错误；划线接种时，泡菜汁无需进行多次稀释，B项错误；乳酸菌是厌氧菌，需在无氧条件下培养，C项正确；泡菜汁中还有酵母菌等，因此分离得到的微生物不只有乳酸菌，D项错误。
4.答案：（1）氮源、碳源
（2）A菌能在培养平板中生长繁殖
（3）稀释；溶菌圈
（4）假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂
解析：（1）蛋白胨主要为细菌提供氮源、碳源和维生素等。
（2）将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊，表明A菌能在培养平板中生长繁殖。
（3）将含菌量较高的湖泊水样稀释后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。
（4）略。
5.答案：C
解析：A、沸盐水冷却后再倒入坛中主要是为了防止乳酸菌被杀死，A错误；B、盐水需要浸没全部菜料主要目的是创造一个无氧的环境，有利于乳酸菌的发酵，B错误；C、盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水目的是使气体只能从泡菜坛排出而不能进入，保证坛内处于无氧环境，C正确；D、泡菜腌制过程中，亚硝酸盐含量先升高，后降低，D错误。故选：C。
6.答案：AB
解析：A、家庭制作果酒和啤酒的工业化生产都是酵母菌无氧呼吸产生酒精的过程，A正确；B、酵母菌在营养充足和有氧条件下通过无性生殖大量繁殖，B正确；C、工业化生产啤酒，为了避免在发酵过程中杂菌的污染，在发酵前需要对原料进行灭菌处理，家庭制作果酒时需要用到水果表面的酵母菌，所以不能对原料灭菌，C错误；D、酵母菌不是有害菌种，家庭制作果酒发酵结束后不需要消毒处理，啤酒的工业化生产需要消毒，D错误。故选：AB。

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