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第三章 基因工程
——高二生物学人教版（2019）期末复习知识大盘点
第一部分：学习目标整合
1. 认识三种基本工具，阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的特点及作用。
2. 阐明基因工程的原理和基本操作程序。
3. 针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某转基因产品的方案。
4. 尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
5. 举例说出基因工程在遗传育种、疾病治疗与生态环境保护方面的应用
6. 举例说出蛋白质工程崛起的缘由，概述蛋白质工程的基本原理，简述蛋白质工程已有的实际应用。
第二部分：教材习题变式
【教材课后习题】
1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR）人、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。
请根据以上信息回答下列问题。
（1）在第②步中，应怎样选择限制酶？
（2）在第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质？
（3）选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行实验有哪些优势？
（4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什么颜色？为什么？
2.科学家将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞中，然后在培养ES细胞的培养基上培养这些细胞。2~3周后，这些细胞显示出ES细胞的形态、具有活跃的分裂能力，它们就是iPS细胞。请回答下列问题。
（1）在这个实验过程中，逆转录病毒的作用是什么？
（2）如何证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用？
（3）如果要了解Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因在诱导iPS细胞时，每个基因作用的相对大小，该如何进行实验？请你给出实验设计的思路。
（4）若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPS细胞，再使它转化为需要的细胞，用这些细胞给该病人治病，这是否会引起免疫排斥反应？为什么？iPS细胞具有分裂活性，用它进行治疗时可能存在什么风险？
3.水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术来减少施用氮肥的生产成本及可能造成的环境污染，他们提出了以下两种方案。
方案一把根瘤菌的固氮相关基因导入水稻根系微生物中，使微生物能在根系处固氮，从而减少氮肥的施用量。
方案二直接将固氮相关基因导入水稻细胞中，建立水稻的“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，这样就可以免施氨肥了。
（1）请评估这两种方案哪种更容易实现。
（2）如果两个方案都实现的话，你认为哪种更值得推广？请说出你的理由。
1.答案：（1）①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶。②为了避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因所在片段和质粒。③切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择。
（2）加入DNA连接酶。
（3）AmpR为氨苄青霉素抗性基因，在培养基中加入AmpR，没有导入任何外源DNA的大肠杆菌不能在该培养基上生存。LacZ基因编码的酶能分解X-gal产生蓝色物质，若大肠杆菌菌落呈现蓝色，则说明导入的是不含目的基因的空白质粒，AmpR和LacZ基因可以将成功导入目的基因的重组质粒筛选出来。
（4）白色。限制酶切割质粒时，会使LacZ基因破坏，含重组质粒的大肠杆菌不含LacZ基因，所以X-gal不会分解产生蓝色物质，菌落呈现白色。
2.答案：（1）逆转录病毒相当于基因工程中的载体。
（2）可设立对照组：将正常的小鼠成纤维细胞放在培养ES细胞的培养基上培养，之后观察是否出现iPS细胞。
（3）思路：将这4种基因分别导入小鼠的成纤维细胞，放在培养ES细胞的培养基上培养，观察细胞的形态、分裂能力等，从而得出每一个基因作用的相对大小。
（4）不会，因为这些细胞来源于同一个体，遗传物质都是相同的。iPS细胞具有分裂活性，这也是癌细胞具有的特点，可能iPS细胞会过度增殖。
3.答案：（1）方案一更容易实现，因为根瘤菌与水稻根系微生物的亲缘关系更近。
（2）方案二更值得推广，因为这种方法可以使水稻自己固氮，不受根系微生物的限制，同时含有的固氮基因还能遗传给子代。
【变式训练】
1.角蛋白酶（KerA）能降解角蛋白，在饲料工业中具有广阔的应用前景。实验小组将KerA基因导入大肠杆菌中，获得了能高效表达KerA的工程菌，如图表示KerA基因重组质粒的构建和筛选过程，（注：TikⅢ、BamHI、EcoRI和PstI表示限制酶，APr表示氨苄青霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因，大肠杆菌不含氨苄青霉素抗性基因和新霉素抗性基因）。请回答下列问题：
（1）构建重组质粒时宜选用___________两种限制酶切割目的基因和质粒，而不选用另外两种限制酶的原因是___________。
（2）将重组质粒导入大肠杆菌时要用___________处理大肠杆菌，目的是___________。大肠杆菌细胞作为原核细胞，常作为基因工程的受体细胞，其优点是___________（答出两点）。
（3）影印接种就是用丝绒做成与平板大小相近的印章，然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒印章上，轻轻印一下，再把此印章在新的培养基平板上轻轻印一下。经培养后，比较平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置，推测可能导入了重组质粒的菌落。筛选重组质粒时，培养基甲应添加的抗生素是___________，培养基乙添加的抗生素是___________，根据图示结果，从培养基甲中应选择编号为___________的菌落进行选择培养，其他菌落导入的是___________。
2.受到放射性污染的核废水一旦排放入海，将对全球生态环境造成重大影响。某小组从耐辐射奇球菌中克隆出抗胁迫调节基因（pprⅠ基因），研究转pprⅠ基因油菜对放射性污染物133Cs（铯）的吸收能力，结果如下表。回答下列各题：
133Cs浓度（mmoL·kg-1） 非转基因 转基因
地上部分含量（mg·g-1） 根系含量（mg·g-1） 地上部分含量（mg·g-1） 根系含量（mg·g-1）
05 1.39 1.73 1.24 2.11
10 2.79 4.42 2.37 4.59
5.0 6.30 6.37 4.58 9.69
10 8.77 10.02 7.55 12.54
（1）与细胞中DNA复制不同的是，利用PCR技术扩增pprⅠ基因时无需添加解旋酶，而是通过____________的方式使模板DNA解旋为单链。
（2）通常采用____________（酶）将pprⅠ基因与Ti质粒构建成基因表达载体。为检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上，可采用________技术，以________为探针进行杂交。利用分子杂交技术检测发现，某些受体植物细胞中的pprⅠ基因无法转录，其原因最可能是_________________________。
（3）由表可知，对133Cs污染的土壤进行生物修复时，应优先选择转pprⅠ基因油菜，其原因在于___________。在后续处理中，应加强对转基因油菜__________（填“地上部分”或“根系”）的处理，这是因为_____________________。
3.棉花是重要的经济纤维作物，土壤盐分过高会对棉花的生产产生严重影响，因此筛选耐盐棉花品种成为棉花农业生产中急需解决的问题。径柳匙叶草液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因（TaNHX2基因）有利于提高植物的耐盐能力，科研工作者将TaNHX2基因转移到棉花细胞内，获得了转基因耐盐棉花新品种。回答下列问题：
（1）科研人员在获得TaNHX2基因对应的核苷酸序列时，利用DNA合成仪直接合成目的基因，该种获取目的基因的方法为_____。
（2）构建基因表达载体时，科研人员将TaNHX2基因整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，一般用相同的限制酶切割目的基因和Ti质粒的_____片段，目的是_____。构建成功的基因表达载体应含有启动子、终止子、_____（答出三种）等结构。
（3）转化后的棉花细胞进行组织培养发育成完整植株，组织培养常用的培养基所含有的主要成分除了水、无机营养成分和有机营养成分外，还有_____（答出两种）等。
（4）为了检测技术成果，科研工作者在个体水平上的检测方法是_____。
1.答案：（1）EcoRI和PstI；TikⅢ会破坏质粒的复制原点，而BamHI会破坏目的基因
（2）Ca2+；使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态；细胞结构简单、繁殖速度快、遗传物质相对较少
（3）新霉素；氨苄青霉素；b、c；不含目的基因的普通质粒
解析：（1）构建重组质粒时需要切割含目的基因的DNA片段和质粒，分析图示可知，应该用EcoRI和PstI两种限制酶同时进行切割，不使用其他两种酶切割的原因是TihⅢ会破坏质粒的复制原点，而BamHI会破坏目的基因。
（2）将外源DNA分子导入大肠杆菌前要用钙离子处理大肠杆菌，目的是增大大肠杆菌细胞膜的通透性，使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的感受态。原核细胞作为基因工程的受体细胞的优点在于细胞结构简单、繁殖速度快。遗传物质相对较少。
（3）PstI进行切割时破坏质粒上的氨苄青得素抗性基因，根据图示可知，b和c菌落能在培养基甲中增殖，但不能在培养基乙中增殖。因此培养甲添加的是新霉素，培养基乙添加的是氨苄青霉素。b、c菌落不能在培养基乙中生长，说明其插入了目的基因，质粒上的氨苄青霉素抗性基因被破坏；质粒上含有新霉素抗性基因的菌落仅仅能在新霉素培养基上增殖，因此其他菌落插入的是不含目的基因的普通质粒。
2.答案：（1）加热到90-95℃（高温）
（2）限制酶和DNA连接酶；DNA分子杂交；放射性同位素标记目的基因；pprⅠ基因在Ti质粒上的插入位点不在启动子和终止子之间
（3）转基因油菜整株植物（地上部分和根系）中的133Cs吸收量大于非转基因油菜；根系；转基因油菜的根系中133Cs吸收量大于地上部分
解析：（1）在体外利用PCR技术扩增目的基因时，利用DNA的高温变性加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使 DNA解链变为单链。
（2）基因工程在构建基因表达载体时，通常用限制酶和DNA连接酶将pprⅠ基因与Ti质粒连接成重组质粒；DNA分子杂交是指以放射性同位素标记目的基因为探针，进行杂交，若出现杂交带则说明含有目的基因，若没有出现则说明目的基因未转入；启动子和终止子分别控制转录的起始和终止，某些受体植物细胞中的pprⅠ基因无法转录，其原因可能是pprⅠ基因在Ti质粒上的插入位点不在启动子和终止子之间，无法启动正常的转录过程。
（3）由表可知，转基因油菜整株植物（地上部分和根系）中的133Cs吸收量大于非转基因油菜，有利于对 133Cs污染的土壤进行生物修复；由于转基因油菜根系对 133Cs的吸收量大于地上部分，在后续处理中，应加强对转基因油菜根系的处理。
3.答案：（1）化学合成法
（2）T-DNA；有利于目的基因和载体形成相同的末端，以便于目的基因和载体的连接；目的基因、标记基因、复制原点
（3）琼脂、植物激素
（4）将转基因棉花种植在盐碱地上，观察其生长状况
解析：（1）获取目的基因的方法有从基因文库中获取、PCR扩增和化学合成法等，通过DNA合成仪直接人工合成属于化学合成法。
（2）对于棉花通常采用农杆菌转化法将目的基因转移至受体细胞。将目的基因整合到农杆菌的Ti质粒的T-DNA上，可使目的基因在农杆菌感染植物细胞的过程中随着T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，随受体细胞DNA进行复制和表达。因此在构建基因表达载体时，一般用相同的限制酶切割目的基因和Ti质粒的T-DNA片段，目的是有利于目的基因和载体形成相同的末端，以便于目的基因和载体的连接。构建成功的基因表达载体应含有启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等结构。
（3）植物组织培养常用的培养基所含有的主要成分除了水、无机营养成分和有机营养成分外，还有琼脂、植物激素等。
（4）结合目的基因的功能，人们可将转基因棉花种植在盐碱地上，观察其生长状况，从而在个体水平上检测目的基因是否成功表达。
第三部分：重难知识易混易错
一、基因工程的概念与原理
1.基因工程的概念
（1）操作场所：生物体外。
（2）操作技术：转基因等技术。
（3）操作结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
（4）操作水平：DNA分子水平。
2.基因工程的原理
基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效地表达。
具体地说，基因工程就是在DNA分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
3.基因工程的诞生和发展
（1）基因工程的诞生
①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
②1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
③1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
④20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现，为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
⑤1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。
（2）基因工程的发展
①1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。
②1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
③1985年，穆里斯等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。
④1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。
⑤21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因序列的了解。
⑥2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。
【例】下列叙述符合基因工程概念的是（ )
A.在细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，赋予生物新的遗传特性
B.将人的干扰素基因与质粒重组后导入大肠杆菌，获得能产生人的干扰素的菌株
C.用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后，其DNA整合到细菌DNA上
答案：B
解析：基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程不能在生物细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，A不符合基因工程的概念；将人的干扰素基因与质粒重组后导入大肠杆菌，获得能产生人的干扰素的菌株，B符合基因工程的概念；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株，属于诱变育种，C不符合基因工程的概念；自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌，并将自身DNA整合到细菌DNA上，属于基因重组，D不符合基因工程的概念。
二、DNA重组技术的基本工具
1.限制性内切核酸酶（又称限制酶）——“分子手术刀”
（1）来源：主要来自原核生物。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（3）结果：产生黏性末端或平末端。
（4）应用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同（填“相同”或“不同”），说明限制酶具有专一性。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
（1）作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（2）种类
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
作用 缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）种类
①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的、环状的、裸露的DNA分子，独立于拟核之外。
②λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。
（2）目的
①将目的基因转运到宿主细胞中去。
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
（3）必备条件
①在宿主细胞中保存下来并大量复制。
②有多个限制酶切割位点。
③有一定的标记基因，便于筛选。
④对受体细胞无害。
4.重组DNA分子的模拟操作
（1）材料用具：剪刀代表EcoRⅠ，透明胶条代表DNA连接酶。
（2）切割位点：
①分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出—GAATTC—序列，并选G—A之间作切口进行“切割”。
②再从另一条链上互补的碱基之间寻找EcoR Ⅰ相应的切口剪开。
（3）操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能互补配对；否则，说明操作有误。
5.DNA的粗提取与鉴定
（1）实验原理
①DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精。
②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2_mol/L的NaCl溶液。
③在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
（2）实验步骤
称取30 g洋葱，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
↓
漏斗中垫纱布，将研磨液过滤到烧杯中，4 ℃处理，取上清液。
↓
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
↓
取两支20 ml的试管编号A、B，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混匀后，将试管置于沸水中加热5 min。
↓
结果观察：A试管不变蓝，B试管变蓝色。
【例】下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是（ )
A.用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B.限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性内切核酸酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接
D.只有用相同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
答案：B
解析：用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，又因DNA为双链结构，因此要断裂4个磷酸二酯键，即被水解的磷酸二酯键有4个，A错误；限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，B正确；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性核酸内切酶切出的黏性末端不同，分别为—CATG和—CTAG，因此不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，则也能形成重组质粒，D错误。
三、基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
1.目的基因
（1）概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
（2）实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。
2.筛选合适的目的基因
（1）较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2）实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3）认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
（2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3）过程：
①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链。
②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链。
④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即呈指数形式扩增（约为2n）。
基因表达载体的构建与将目的基因导入受体细胞
1.基因表达载体的构建——核心
（1）构建基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
两子启动和终止；目的基因在中间；标记基因来筛选。
3.基因表达载体的功能
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
（2）使目的基因表达和发挥作用。
将目的基因导入受体细胞
1.转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.转化方法
（1）导入植物细胞
（1）农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物。
（2）基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
（3）花粉管通道法：我国科学家独创的一种方法。
（2）导入动物细胞
①常用方法：显微注射技术。
②常用受体细胞：受精卵。
（3）导入微生物细胞
①方法
a.用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（这种细胞称为感受态细胞）。
b.感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子。
②受体细胞：原核细胞（使用最广泛的是大肠杆菌）。
③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
目的基因的检测与鉴定
1.分子水平检测
（1）检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因。
方法：DNA分子杂交技术。
（2）检测目的基因是否转录出mRNA。
方法：分子杂交技术。
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质。
方法：抗原—抗体杂交技术。
2.个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
【例】研究人员欲从酵母菌中获取某种酶的基因，并导入棉株表达，下列叙述不正确的是（ )
A.可用PCR技术在短时间内获得大量编码该酶的基因
B.以酵母菌中有关mRNA为模板合成目的基因的过程为逆转录
C.应使用PCR技术检验基因是否成功在棉株中表达
D.如果销售这种转基因棉籽榨成的油，应当在包装上标明其原料为转基因农作物
答案：C
解析：利用PCR技术可以在短时间内获得大量目的基因，A正确；酵母菌的遗传物质是DNA，以mRNA为模板合成DNA的过程为逆转录，B正确；目的基因是否成功在棉株中表达要看棉株中是否产生了相应的酶，可用抗原—抗体杂交技术检验，C错误；根据我国的有关规定，用转基因生物加工成的产品，应当进行标识，保护消费者知情权，D正确。
四、基因工程在农牧业方面的应用
1.发展
（1）农牧业：1996—2017年，全世界转基因作物的种植面积增加了一百多倍，美国是世界上转基因作物种植面积最大的国家。2017年，我国转基因作物种植面积居世界第八位。
（2）动物：第一种用于食用的转基因动物——转基因大西洋鲑在美国获得批准上市。
2.实例
（1）转基因抗虫植物
①技术方法：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中，培育出具有抗虫性的作物。
②实例：抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。
（2）转基因抗病植物
①技术方法：将来源于病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出转基因抗病植物。
②实例：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。
（3）转基因抗除草剂植物
①技术方法：将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可培育抗除草剂的作物品种。
②实例：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。
（4）改良植物的品质
①技术方法：将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。
②实例：转基因玉米中赖氨酸的含量比对照高30%。
（5）提高动物的生长速率
①技术方法：将外源生长激素基因导入动物体内，提高动物的生长速率。
②实例：转基因鲤鱼。
（6）改善畜产品的品质
①技术方法：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组。
②实例：乳汁中乳糖含量大大降低的转基因奶牛。
【例】下列关于植物基因工程应用的说法，错误的是（ )
A.将动物的某种蛋白质基因导入植物体中用来生产该蛋白质
B.植物基因工程可用来培育高产、稳产、品质优良和抗逆性强的作物
C.利用基因工程可以改造植物细胞的基因，使其能够生产人类所需要的药物
D.通过植物基因工程培育的抗虫植物必然可以抗病毒
答案：D
解析：所有生物共用一套遗传密码，因此将动物的某种蛋白质基因导入植物体中可生产该蛋白质，A正确；可以将抗逆性强、高产等基因导入植物体内，培育出具有相应优良性状的作物，B正确；利用基因工程可以改造植物细胞的基因，使其能够生产人类所需要的药物，例如紫草宁等，C正确；通过基因工程培育的抗虫植物只能抗某种或某类虫害，不能抗病毒，D错误。
五、基因工程在医药卫生领域以及食品工业方面的应用
1.基因工程在医药卫生领域的应用
（1）技术方法
①生产药物
a常见的药物：细胞因子、抗体、疫苗和激素等。我国生
产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。
b批量生产药物：乳腺（房）生物反应器。
目的基因：药用蛋白基因。
启动子：乳腺中特异性表达的基因的启动子。
受体细胞：受精卵。
②培育移植器官：在器官供体的基因组中导入某种调节因子抑制抗原决定基因的表达或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆器官。
2.基因工程在食品工业方面的应用
（1）技术方法：利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵生产凝乳酶。
（2）实例：淀粉酶、脂酶、天冬氨酸和苯丙氨酸。
【例】下列关于基因工程在食品工业方面的应用的叙述，错误的是（ )
A.用于形成阿斯巴甜的主要氨基酸可以通过基因工程大规模生产
B.基因工程获得凝乳酶时，需将编码凝乳酶的基因导入受体菌的基因组中
C.相比从天然产物中提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶的纯度较低
D.生产淀粉酶和脂酶时，可通过构建工程菌，用发酵技术大量生产
答案：C
解析：阿斯巴甜主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸可以通过基因工程大规模生产，A正确；基因工程获得凝乳酶时，需将编码凝乳酶的基因导入受体菌，如大肠杆菌、黑曲霉等的基因组中，B正确；相比从天然产物中提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶的纯度较高，C错误；生产淀粉酶和脂酶时，可通过构建工程菌，用发酵技术大量生产，D正确。
六、蛋白质工程
1.蛋白质工程崛起的缘由
基因工程的不足
（1）基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新性状。
（2）不足：在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。
天然蛋白质的不足
（1）天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
（2）对天然蛋白质进行改造，应该从对基因的操作来实现，主要原因如下：
①任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的基因可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传。
②对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易，难度要小得多。
蛋白质工程的崛起
（1）理论和技术条件：分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展。
（2）实例
蛋白质缺陷 改造措施 改造后效果
玉米中赖氨酸含量低 赖氨酸合成中两种酶的氨基酸被替换 玉米叶片和种子中游离赖氨酸分别提高5倍和2倍
2.蛋白质工程的基本原理
概念
（1）基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
（2）手段：通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。
（3）目的：获得满足人类的生产和生活需求的蛋白质。
与基因工程的关系：在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
原理
（1）目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
（2）方法：改造基因或合成基因。
（3）流程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
蛋白质工程流程图
3.蛋白质工程的应用
医药工业方面
（1）速效胰岛素类似物：改变氨基酸序列，抑制胰岛素的聚合。
（2）干扰素：一个半胱氨酸替换为丝氨酸，延长保存时间。
（3）单克隆抗体：将小鼠抗体上结合抗原的区域“嫁接”到人的抗体上，降低诱发免疫反应的强度。
其他工业方面：广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。如枯草杆菌蛋白酶。
农业方面
（1）改造某些参与调控光合作用的酶，提高植物光合作用的效率。
（2）改造微生物蛋白质的结构，增强防治病虫害的效果。
【例】如何更快速、准确地确定蛋白质的三维空间结构，这一直是生命科学领域的研究热点和难点。人工智能程序AlphaFold2对大部分蛋白质结构的预测极为精准，接近真实的蛋白质结构，达到了人类利用冷冻电镜等复杂仪器观察预测的水平。下列相关叙述不正确的是（ )
A.蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础
B.预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程
C.结构预测有助于人们揭示蛋白质分子间相互作用的机制
D.依据新蛋白质的氨基酸序列能推出唯一的基因序列
答案：D
解析：天然蛋白质合成过程中要先形成具有特定氨基酸序列的多肽链，再形成具有高级结构的蛋白质，蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础，A正确；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程，B正确；结构决定功能，结构预测有助于人们了解蛋白质如何行使其功能，揭示蛋白质分子间相互作用的机制，C正确；一个氨基酸对应的密码子可能有多个，因此依据新蛋白质的氨基酸序列可能推出多个基因序列，D错误。
第四部分：核心素养对接高考
本专题多以最新科技信息材料的形式，结合细胞工程与胚胎工程进行考查。主要考查内容有：基因工程工具的作用和特点、基因工程操作步骤、基因工程在工农业生产和实践中的应用。
【2023·山东卷】1.科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________（答出2个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带l证明细胞内表达了________，条带2所检出的蛋白________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
【2023·湖北卷】2.用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ )
A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
【2023·广东卷】3.种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
（2）用PCR反应扩增DA1基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。
（3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
【2023·天津卷】4.某植物四号染色体上面的A基因可以指导植酸合成，不能合成植酸的该种植物会死亡。现有A3-和A25-两种分别由A基因缺失3个和25个碱基对产生的基因，已知前者不影响植酸合成，后者效果未知。
（1）现有基因型为AA25-的植物，这两个基因是_______基因。该植物自交后代进行PCR，正向引物与A25-缺失的碱基配对，反向引物在其下游0.5kb处，PCR后进行电泳，发现植物全部后代PCR产物电泳结果均具有明亮条带，原因是______________，其中明亮条带分为较明亮和较暗两种，其中较明亮条带代表基因型为_______的植物，比例为_______。
（2）将一个A基因导入基因型为A3-A25-的植物的6号染色体，构成基因型为A3-A25-A-的植物、该植物自交子代中含有A25-A25-的比例是_______。
（3）在某逆境中，基因型为A3-A3-的植物生存具有优势，现有某基因型为A3-A的植物，若该种植物严格自交，且基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，补齐下面的表格中，子一代基因频率数据（保留一位小数）：
代 亲代 子一代 子二代
A基因频率 50% _______% 46.9%
A3-基因频率 50% _______% 53.1%
基因频率改变，是_______的结果。
1.答案：（1）RNA聚合酶；限制酶切位点、标记基因、复制原点等
（2）F1和R2；a
（3）标签短肽V5；不是
2.答案：D
解析：若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet（四环素）培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，不能在含Tet（四环素）的培养基中形成菌落，D错误。
3.答案：（1）野生型
（2）Ti质粒；启动子和终止子
（3）①DA1基因（和卡那霉素抗性基因）；②75；③自交；100；如图所示
解析：（1）据题干信息可知，突变体是由野生型DA1基因发生隐性突变形成的，采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由隐性突变造成，由于转入的基因为显性基因，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
（2）构建基因表达载体时，需要用限制性核酸内切酶对经过PCR扩增的DA1基因和作为运载体的Ti质粒进行切割。为确保插入的DA1基因可以正常表达，DA1基因（目的基因）的上下游需具备启动子和终止子。
（3）①卡那霉素抗性基因为标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。用农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在含有卡那霉素的培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了DA1基因（和卡那霉素抗性基因）。②假设DA1基因用A表示，结合题中信息知，T1代中能在含有卡那霉素的培养基上生长的植株的基因型为Aa或AA或多位点插入，T1代阳性植株自交所得T2代种子按单株收种并播种于含有卡那霉素的培养基上，T1代阳性植株基因型为Aa时，该植株上所结种子有75%能够萌发并长成幼苗，因此，应选择阳性率约为75%的培养基中幼苗继续培养。③T2代阳性植株的基因型为1/3AA、2/3Aa，将②中选出的T2代阳性植株自交，所得的T3代种子按单株收种并播种于含有卡那霉素的培养基上，基因型为AA的植株自交，其后代不会发生性状分离，在含有卡那霉素的培养基上，所有种子都能够萌发并生长，而基因型为Aa的植株自交，其后代会发生性状分离，在含有卡那霉素的培养基上部分种子不能萌发，因此阳性率达到100%的培养基中的幼苗为纯合子（AA），即目标转基因植株。分析题图可知，野生型相关基因中不含限制性核酸内切酶X的识别序列，不能被该酶切割，已知DA1基因的长度为150bp，因此，野生型相关基因被限制性核酸内切酶X切割并电泳后得到的条带为150bp。突变型相关基因中含有限制性核酸内切酶X的识别序列，用该酶切割后，突变基因被切割成100bp、50bp两种DNA片段，经电泳后得到的条带为100bp和50bp。突变型和野生型相关基因经限制性核酸内切酶X切割并电泳后得到的结果如图所示。
4.答案：（1）等位；自交后代中基因型为A25-A25-的个体死亡，基因型为A25-A和AA的个体由于都至少含有一个A基因，因此可以与正向引物和反向引物结合进而完成PCR，获得明亮条带；AA；1/3
（2）1/5
（3）48.8%；51.2%；自然选择
解析：（1）由题干可知，A25-基因是由A基因缺失25个碱基对产生的基因，即A基因通过基因突变产生A25－基因，因此二者属于等位基因。基因型为AA25-的植物自交后代的基因型及其比例为AA：AA25-：A25-A25-=1：2：1。当对这些后代进行PCR时，正向引物与A25-缺失的碱基配对，反向引物在其下游0.5kb处，可推知缺失这25个碱基对的A25-基因无法与正向引物配对从而不能扩增，因此只含有A25－基因的个体（即A25-A25-）不具有条带；含有这25个碱基对的A基因才能与正向引物和反向引物都进行碱基互补配对从而扩增出条带，因此基因型为AA、AA25－的个体均具有条带，且A基因个数越多，扩增产物越多，条带越明亮，因此基因型为AA的个体具有较明亮的条带，基因型为AA25-的个体具有较暗的条带。由题干可知，该植物的全部后代都具有明亮条带，说明基因型为A25-A25-的个体无法存活，只有基因型为AA和AA25－的个体能够存活下来，并进行了PCR扩增产生了条带，因此较明亮条带代表基因型为AA，占比为1/3。
（2）已知基因A3-和A25-都在4号染色体上，再导入一个A基因至6号染色体上，由于它们位于不同对染色体上，故该植物在减数分裂产生配子时，遵循基因自由组合定律，产生配子的基因型为A3-A、A25-A、A3-、A25-，比例各自占1/4；该植物自交后代中基因型为A25-A25-=1/4×1/4=1/16的个体死亡，存活个体占1-1/16=15/16，含有A25-A25-的后代个体基因型有2种，分别是AAA25-A25-=1/4×1/4=1/16，AA25-A25-=1/4×1/4×2=2/16，二者共占3/16，因此该植物自交子代中含有A25-A25-的比例是3/16÷5/16=1/5。
（3）基因型为A3-A的植物自交产生子一代的基因型及比例为AA=1/4，A3-A=1/2，A3-A3-=1/4，由题干可知，基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，则子一代中A3-A3-=1/4+1/4×10%=11/40，因此子一代中AA:A3-A:A3-A3-=1/4：1/2：11/40=10:20:11，可计算出三者的基因型频率分别是AA=10÷（10+20+11）=10/41，A3-A=20÷（10+20+11）=20/41，A3-A3-=11÷（10+20+11）=11/41，可进一步计算出子一代中A基因频率=10/41+1/2×20/41=48.8%，A3-基因频率=11/41+1/2×20/41=51.20%。自然选择导致具有有利变异的个体存活并由更大几率产生更多后代，导致后代中决定有利变异的基因频率增大，而具有不利变异的个体则会被自然选择淘汰，因此决定不利变异的基因频率减小，因此基因频率的改变是自然选择的结果。

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