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(共156张PPT)
第2节
基因工程的基本操作程序
第3章 基因工程
选修三
问题探讨
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。
如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？
转基因抗虫棉
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因 转入普通棉花
问题探讨
培育转基因抗虫棉的简要过程
苏云金杆菌
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达 Bt基因
导入
与载体拼接
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
（核心）
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
Bt基因
目的基因的筛选与获取
1
基因表达载体的构建
2
目录
将目的基因导入受体细胞
3
DNA片段的扩增及电泳鉴定
5
习题检测
6
目的基因的检测与鉴定
4
1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。
2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
一、学习目标
二、重点
1.基因工程基本操作程序的四个步骤。
利用PCR获取和扩增目的基因。
三、难点
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定。
目的基因的筛选与获取
1
目的基因的筛选与获取
1
一、目的基因的筛选
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性基因
生产药物基因
毒物降解基因
工业用酶基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
1.目的基因
习题巩固
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
一、目的基因的筛选
苏云金杆菌
制成
杀虫剂
掌握目的基因的功能
掌握目的基因的结构
防治棉花害虫
发现杀虫作用与Bt基因有关
掌握Bt基因的序列
深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
目的基因的筛选与获取
1
一、目的基因的筛选
2.筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。
认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
2.筛选合适的目的基因
测序技术
序列数据库
（如GenBank）
序列比对工具
（如BLAST）
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
基因通常是有遗传效应的DNA片段
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。
非编码区：不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段。
基因的结构
基因的结构
1.原核生物的基因结构
启动子
终止子
编码区
非编码区
非编码区
编码区上游
编码区下游
连续的、不间隔的
RNA聚合酶识别并结合的位点，
驱动基因转录出mRNA。
启动子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因上游
基因的结构
1.原核生物的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
连续的、不间隔的
终止转录。
终止子
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因下游
基因的结构
2.真核生物的基因结构
启动子
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
间隔的、不连续的
内含子
外显子
外显子
内含子
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。
基因的结构
2.真核生物的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
转录
初级RNA
成熟mRNA
剪切、拼接
基因的结构
原核生物 真核生物
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都有能够编码蛋白质的 和 具有调控作用的 区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
非编码序列
=非编码区
原核基因
非编码序列
真核基因
=非编码区+内含子
目的基因的筛选与获取
1
二、目的基因的获取方法
3.利用PCR获取和扩增目的基因
1.从基因文库中获取
2.通过DNA合成仪直接合成
1.从基因文库中获取
（1）基因文库的构建过程
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
1.从基因文库中获取
（2）基因文库的类型
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
①基因组文库的构建
提取某生物
全部DNA
用适当
限制酶切割
许 多
DNA片段
该生物
基因组文库
每个受体菌含有一段不同的DNA片段
与载体连接
导入受体菌群
含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体
1.从基因文库中获取
含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
②cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成
mRNA
杂交双链
单链DNA
双链cDNA
(cDNA)
该生物
cDNA文库
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子，
cDNA文库中的基因不含以上结构。
与载体连接
导入受体菌群
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
某一发育时期
质粒
质粒
cDNA片段
逆转录酶
导入细菌中
逆转录
cDNA
mRNA
cDNA文库
细胞
基因组DNA
质粒
质粒
DNA片段
导入细菌中
基因组文库
二、目的基因的获取方法
1.从基因文库中获取
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
习题巩固
1.下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是(　　)
A.cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，
基因组文库中含有某种生物的全部基因
B.如果某种生物的cDNA文库中的某个基因
与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，
则这两个基因的结构也完全相同
C.cDNA文库中的基因没有启动子
D.一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种
B
目的基因的筛选与获取
1
二、目的基因的获取方法
2.通过DNA合成仪直接合成
（1）前提
（2）方法
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
目的基因的mRNA
单链DNA (cDNA）
双链DNA
(即目的基因)
反转录
合成
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
推测
推测
目的基因
化学合成
2.通过DNA合成仪直接合成
反转录法
根据已知的氨基酸序列合成DNA
目的基因的筛选与获取
1
二、目的基因的获取方法
3.利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
PCR——聚合酶链式反应
1.解旋：在ATP的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开。
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
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A
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C
G
A
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C
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A
C
G
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A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
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T
A
3'
5'
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
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T
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C
G
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T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
ATP
解旋酶
体内DNA复制的过程
2.定序：游离的脱氧核苷酸按碱基互补配对原则随机地与两条母链
的碱基配对，确定子链的脱氧核苷酸排列顺序。
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
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A
G
C
C
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3'
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T
T
形成氢键
体内DNA复制的过程
C
C
G
T
A
G
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C
G
G
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C
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G
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A
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A
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A
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A
3'
5'
A
C
G
C
A
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C
T
A
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T
A
T
A
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G
C
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T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
3.合成子链：在DNA聚合酶的催化下从子链的5'端把子链的脱氧
核苷酸聚合成脱氧核苷酸链。
合成方向：
子链的5'端→ 3'端
形成磷酸二酯键
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
DNA聚合酶
5'
3'
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
ATP
ATP
体内DNA复制的过程
4.形成子代DNA分子：每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
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A
G
C
C
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C
C
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A
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3'
5'
A
C
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T
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5'
3'
T
A
G
C
C
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A
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G
C
C
G
A
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A
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3'
5'
T
T
A
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5'
3'
体内DNA复制的过程
（2）体内DNA复制所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR的原理
DNA半保留复制
引物
3′
5′
子链的延伸方向是5 ′→3 ′
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
子链
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′端
引物为DNA聚合酶提供了游离的3 ′端，使DNA聚合酶从3 ′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
子链合成需要引物
引物
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
什么是引物
子链延伸
子链延伸
引物是决定PCR特异性的关键
-5 ′
3′-
引物
5′-
-3′
5′-
-3′
引物
3′-
-5′
（3）体外DNA复制所需的基本条件
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和
细菌的DNA聚合酶
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
3.利用PCR获取和扩增目的基因
腺嘌呤
核糖
P
P
P
~
~
腺苷三磷酸 （ATP） A- P~P~P
腺嘌呤核糖核苷酸 (AMP）
腺苷二磷酸 （ADP）
腺苷（A)
OH
OH
腺苷三磷酸
脱氧核苷三磷酸
dATP
腺嘌呤脱氧核苷酸
dADP
腺苷（A)
腺嘌呤
脱氧
核糖
P
P
P
~
~
OH
H
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
参与的组分 在PCR的作用
目的基因DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
引物
缓冲液
Mg2+
高温
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸（两种）
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
维持反应体系的pH
激活DNA聚合酶的活性
（3）体外DNA复制所需的基本条件
（3）体外DNA复制所需的基本条件
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
引物（2种）
待扩增DNA片段
5’
5’
含Mg2+的缓冲溶液
第1步：变性
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
当温度超过90℃时，
双链DNA解旋为单链。
95℃
（4）PCR的过程
3.利用PCR获取和扩增目的基因
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第2步：复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
50℃
长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高
（4）PCR的过程
思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。
原因是
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的
碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
（4）PCR的过程
第2步：复性
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第3步：延伸
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
72℃
（4）PCR的过程
DNA解链为单链
高温(95℃)变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。
（4）PCR的过程
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
5′-
-3′
3′-
5’
3′-
-5′
5′-
-3′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
每一次循环后目的基因的量可以增加_____，
即呈_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
一倍
指数
（4）PCR的过程
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
（4）PCR的过程
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
PCR过程归纳
目的基因DNA________后________，____与单链相应互补序列
结合；然后以_________为模板在 作用下进行_____，即将4种___________加到___________，如此重复循环多次。
受热变性
解为单链
引物
延伸
单链DNA
耐高温的DNA聚合酶
引物的3 ′端
脱氧核苷酸
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
变性：加热至90℃以上，___________________;
复性：冷却至 ℃左右，引物与单链DNA结合；
延伸：加热至72℃左右， 从引物起始进行
互补链的合成。如此重复循环多次。
双链DNA解聚为单链
50
耐高温的DNA聚合酶
DNA聚合酶只能特异性地复制处于 之间的DNA序列,使其成指数倍增加。
两个引物
PCR过程归纳
利用PCR获取和扩增目的基因条件
①____：DNA的两条链。
②____：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。
③原料：A、T、G、C四种__________。
④酶： 酶。
⑤其他条件：需要一定的 溶液和能严格控制温度的温控设备。
模板
引物
脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合
缓冲
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，
因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，
即呈_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
产物
模板
一倍
指数
比较细胞内DNA的复制与PCR技术
细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋 方式 解旋酶催化 边解旋边复制
场所 主要在细胞核内
酶 解旋酶、DNA聚合酶等
温度 细胞内温和条件
结果 合成整个DNA分子
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸 ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端合成子链
DNA在高温下变性解旋
全部解旋后再复制
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
耐高温的DNA聚合酶
控制温度，需在不同温度下进行
扩增特定的DNA片段或基因
习题巩固
1.延伸时需要加入两种引物，原因是:
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。
2.两种引物的要求：
①引物自身及引物之间不应存在互补序列；
②引物5'端可以修饰，3'端不可修饰；
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合。
PCR引物的设计
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增高效性。
1.引物设计需考虑的两个因素
扩增
特异性
扩增
高效性
引物
特异性：只扩增出目标DNA的特性
高效性：单位时间内扩增产物的量
特异性太强，扩增效率就会下降
提高扩增效率，扩增特异性就会下降
PCR引物的设计
2.引物设计的原则
（1）引物长度
一般在15-30碱基之间。过长会导致其延伸温度大于74℃，
不适于Taq 酶进行反应。过短特异性差。
（2）引物G-C含量
一般在40%~60%之间，G-C含量过高或过低都不利于引发反应。
2.引物设计的原则
（4）复性温度
复性温度高，扩增特异性强，复性温度低，扩增效率高。
如果引物碱基数较少，可以适当提高复性温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低复性温度，使DNA双链结合。一对引物的复性温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的复性温度是一样的。
（3）引物自身及引物之间不应存在互补序列
碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或引物之间配对结合，从而影响引物与模板的复性结合。
2.引物设计的原则
引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。
（5）引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰
PCR引物的设计
2.引物设计的原则
①引物长度要适宜
②引物G-C含量要适宜
③引物自身及引物之间不应存在互补序列
④引物5'端可以修饰，3'端不可修饰
⑤复性温度要适宜
设计的目的是在两个目标间取得平衡: 扩增特异性和高效性。
（5）PCR产物鉴定
3.利用PCR获取和扩增目的基因
常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（标准），这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
习题巩固
3.在已知序列信息的情况下，
获取目的基因的最方便方法是（ ）
A.化学合成法
B.基因组文库法
C.cDNA文库法
D.聚合酶式链反应
D
习题巩固
4.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（ ）
①从基因文库中获取目的基因
②利用PCR技术扩增目的基因
③逆转录法
④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③
D
习题巩固
5.下列有关PCR技术的说法，不正确的是(　　)
A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B.PCR技术的原理是DNA双链复制
C.利用PCR技术获取目的基因的前提是
要有一段已知的目的基因的核苷酸序列
D.PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA
D
PCR相关计算
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
1
1
引物A
引物B
扩增一次
PCR相关计算
中长链-短链DNA____个
2
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
3
3
扩增两次
PCR相关计算
中长链-短链DNA____个
4
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
7
7
短链-短链DNA______个
2
出现完整的目的基因
扩增三次
PCR相关计算
中长链-短链DNA____个
6
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
15
15
短链-短链DNA______个
8
扩增四次
PCR相关计算
扩增次数 1次 2次 3次 4次 n次
DNA总数 21 22 23 24 2n
长链-中长链DNA
中长链-短链DNA
短链-短链 DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2(n-1)
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
PCR相关计算
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子数为：___个
②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个
③子代含有的目的基因数目：_____个
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个
⑤复制过程中共需引物_______个
⑥第n次复制需要引物___个
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
2n-2n
习题巩固
6.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有(　　)
A.8个 B.6个 C.4个 D.2个
A
习题巩固
图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为________。
15/16
7.利用PCR技术扩增目的基本因，其原理与细胞内DNA复制类似。
PCR相关应用
扩增目的基因
检测目的基因
产生突变基因
用模板DNA和目的基因相关引物扩增
用待测DNA和
相关引物扩增
有扩增产物则含有目的基因
无扩增产物则不含目的基因
可在引物中或引物的5`端引入突变序列
产生大量目的基因
产生大量突变基因
PCR的应用
习题巩固
8.SRY—PCR是对移植前的胚胎进行性别鉴定的技术。
以Y染色体上SRY基因（性别决定基因）的一段序列作引物，用被测胚胎DNA作_____进行PCR扩增。根据SRY基因序列设计的引物长度一般为20～24个核苷酸，其不宜过短的原因主要是__________________。两种引物中G＋C的含量相差不宜过大，原因主要是________________________________。
防止引物随机结合
C、G含量差别大，
低温复性难统一
模板
习题巩固
9.用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
RNA链
DNA链
mRNA
杂交双链
单链DNA
双链cDNA
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
基因表达载体的构建
2
基因表达载体的构建
2
获得目的基因后直接转入受体吗？
不是。游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
一、基因表达载体的作用
1.使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代;
2.使目的基因在受体细胞中能够表达且发挥作用。
基因表达载体的构建
2
二、基因表达载体的组成
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。
供目的基因插入载体中
便于重组DNA的筛选
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
基因表达载体与基因克隆载体
基因克隆载体必须具备的条件
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
基因表达载体必须具备的条件
基因表达载体插入的目的基因中必须含有能转录出完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点的序列。
基因表达载体的构建
2
三、基因表达载体的构建流程
同种限制酶或同尾酶
或两种酶
DNA
连接酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
限制酶切割位点
质粒
重组
DNA分子
限制酶
限制酶
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
三、基因表达载体的构建流程
目的基因
基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
诱导型启动子
注意事项
1.基因工程中的基因表达载体≠载体：
基因表达载体与载体相比增加了 。
2.目的基因插入位点不是随意的：
习题巩固
1.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是(　　)
A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码
B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，
对mRNA的转录起调控作用
C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选
D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别
A
启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的比较
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学 成分
位置
作用
DNA片段
DNA片段
mRNA上
三个相邻碱基
mRNA上
三个相邻碱基
目的基因首端
目的基因尾端
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出RNA
决定转录
的结束
翻译的
起始信号
决定翻译过程的结束
习题巩固
2.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，
错误的是 (　 　)
A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
B
将目的基因导入受体细胞
3
将目的基因导入受体细胞
3
一、常用的受体细胞
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
二、将目的基因导入受体细胞的方法
1.植物细胞：
2.动物细胞：
3.微生物细胞：
花粉管通道法、农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2+处理法（感受态细胞法）
由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。
花粉管
花粉粒
柱头
花柱
子房
胚囊
卵细胞
胚珠
精子
二、将目的基因导入受体细胞的方法
1.植物细胞
（1）花粉管通道法
我国科学家独创的一种方法
①可以用微量注射器将含
目的基因的DNA溶液
直接注入子房中。
②可以在植物受粉后的一定时间
内，剪去柱头，将DNA溶液滴
加在花柱切面上，使目的基因
借助花粉管通道进入胚囊。
（1）花粉管通道法
优点
①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进
入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的
DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株
的全套人工培养过程。
受精卵
受体细胞
二、将目的基因导入受体细胞的方法
1.植物细胞
（2）农杆菌转化法
①农杆菌是一种在土壤中生活的
微生物，能在自然条件下感染
双子叶植物和裸子植物，而对
大多数单子叶植物没有感染能力。
②当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，
吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA
（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞
的DNA上。
采用最多
表现出新性状的植物
含重组Ti质粒的农杆菌
（2）农杆菌转化法
Ti质粒
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
（2）农杆菌转化法
转化
目的基因进入 内，并且在受体细胞内维持
和 的过程。
受体细胞
稳定
表达
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
（2）农杆菌转化法
__________插入Ti质粒的________中形成重组Ti质粒
重组Ti质粒转入__________
转化植物细胞
目的基因插入植物细胞中的________________上
目的基因在植物细胞中稳定存在并__________
表达
目的基因
T-DNA
农杆菌
染色体DNA
（2）农杆菌转化法
两次拼接
①第一次拼接：
②第二次拼接(非人工操作)：
目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入
将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
①第一次导入：
②第二次导入(非人工操作)：
（2）农杆菌转化法
方法
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与
农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，
并再生成植株；
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌
的溶液一段时间，然后培植植株并
获得种子，再进行筛选、鉴定等。
受体细胞为_______
体细胞
受体细胞为_______
受精卵
（2）农杆菌转化法
习题巩固
1.研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？
转两个T基因
普通棉花细胞
有三种情况，如下图所示。
2.若甲、乙、丙三种植株自交，
其后代抗虫与不抗虫的比例为多少？
甲自交→全为抗虫
乙自交→抗虫：不抗虫=3:1
丙自交→抗虫：不抗虫=15:1
甲
乙
丙
习题巩固
2.(2023·北京海淀区模拟)科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.农杆菌的T-DNA与番木瓜基因发生重组
B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶
C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性
D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性
A
习题巩固
3.(2023·北京民族大学附中期末)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　)
A
A.⑤只要表现出抗虫性状就
表明植株发生了可遗传变异
B.③侵染植物细胞后，重组
Ti质粒整合到④的染色体上
C.④的染色体上若含抗虫基因，
则⑤就表现出抗虫性状
D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
二、将目的基因导入受体细胞的方法
1.植物细胞
（3）基因枪法
适用于单子叶植物
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
二、将目的基因导入受体细胞的方法
2.动物细胞——显微注射法
受精卵
注射器
固定吸管
显微注射仪
将含有目的基因的
表达裁体提纯
→显微注射入动物的受精卵
→受精卵发育
→获得具有新性状的动物
受精卵
受体细胞
习题巩固
4.为什么受体细胞选受精卵而不是正常体细胞？
受精卵具有全能性且体积大，易操作；而动物体细胞的全能性受限。
如果做转基因植物的话，受体细胞可以采用植物的体细胞，因为植物可以组培，即便一个体细胞也可以让他发育成一个完整的植株，但是如果做转基因动物，那就不能用体细胞作为受体细胞，因为要保证全身上下的细胞都带有目的基因，如果已经是一个成熟的个体，只往它身上的某个部位比如肝脏细胞导入基因，就不能保证身体所有细胞都带上，所以唯一的受体细胞就是受精卵。
二、将目的基因导入受体细胞的方法
3.微生物细胞
（1）原核生物作为受体细胞的优点
①繁殖快
②单细胞
③遗传物质少
（2）导入方法——Ca2+处理法（感受态细胞法）
大肠杆菌
感受态细胞
Ca2+
混合
表达载体
缓冲液
溶于
吸收DNA，完成转化
使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态
用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。
胰腺
提取筛选
胰岛素mRNA
胰岛素cDNA
逆转录
重组
质粒
质粒
导入
大肠杆菌
mRNA
胰岛素原
胰岛素
加工
注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质
通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
（2）导入方法——Ca2+处理法（感受态细胞法）
用原核生物生产胰岛素示意图
受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的 T- DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子
二、将目的基因导入受体细胞的方法
拓展
科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
如慢病毒载体、腺病毒载体等。
拓展
腺病毒载体新冠疫苗的制备
将编码新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因组中，接种后，随载体增殖，大量所需的抗原得以表达。
习题巩固
5.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？
如果这么做，效果会怎样？
有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。
习题巩固
6.体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，
下列受体细胞与导入方法匹配错误的是(　　)
选项 受体细胞 导入方法
A 棉花细胞 花粉管通道法
B 大肠杆菌 农杆菌转化法
C 羊受精卵 显微注射技术
D 小麦细胞 基因枪法
B
习题巩固
7.基因工程常用的受体细胞有 （ ）
①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞
A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．①②④
D
8.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作
的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（ ）
A.人工合成基因
B.目的基因与运载体结合
C.将目的基因导入受体细胞
D.目的基因的检测和表达
C
目的基因的检测与鉴定
4
目的基因的检测与鉴定
4
一、分子水平的检测
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
1.检测目的基因是否导入受体细胞
2.检测目的基因是否转录
3.检测目的基因是否翻译
二、个体水平的检测
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
一、分子水平的检测
1.检测目的基因是否导入受体细胞
（1）PCR扩增
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
是否扩增出目的基因
PCR操作
电泳操作
非转基因棉花
转基因抗虫棉
阴性对照
Marker
1.检测目的基因是否导入受体细胞
（2）DNA分子杂交技术
碱基互补配对
原理
探针
目的基因
带标记的基因探针（可以是DNA或RNA），与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
（2）DNA分子杂交技术
1.检测目的基因是否导入受体细胞
（2）DNA分子杂交技术
① 首先取出转基因生物的基因组DNA。
② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素（荧光分子或
化学发光催化剂）等作标记，以此做探针。
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带，
表明目的基因已插入染色体DNA中。
基因探针：一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸
序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA，
探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。
一、分子水平的检测
2.检测目的基因是否转录
（1）RNA分子杂交技术
（2）RT-PCR扩增
转基因生物
提取RNA
RNA作为模板
逆转录
cDNA
PCR操作、电泳
是否扩增出目的基因
一、分子水平的检测
抗原— 抗体杂交技术
3.检测目的基因是否翻译
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
转基因生物
放射性检测
（杂交带）
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
二、个体水平的检测
检测目的基因是否表现出相应的性状。
方法：抗虫鉴定、抗病鉴定等
棉铃虫
棉铃虫（死亡）
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未侵染上病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
二、个体水平的检测
目的基因的检测与鉴定
4
1.目的基因的筛选和获取-前提
DNA合成仪合成
基因文库获取
利用PCR获取和扩增
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、
显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物)
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子水平：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
课堂总结
习题巩固
1.实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。
下列说法错误的是（ ）
习题巩固
A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增
C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交
C
到社会中去
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？
证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
到社会中去
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。
他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？
这些措施的原理是什么？有效吗？
（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。
（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物（非抗品种）轮作或套种等。
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
5
DNA片段的扩增及电泳鉴定
5
一、实验原理
① PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA
双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温
度的仪器。
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
② PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。
一次PCR一般要经历30次循环。
一、实验原理
2.DNA片段电泳鉴定的原理
① DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以
带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着
与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
② PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA
分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁
移速率与之呈负相关）等有关。
③ 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯
下被检测出来。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
2.DNA片段电泳鉴定的原理
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
在电泳开始时使用低压有利于条带清晰，是因为点样之后样品内分子是胡乱排列的，加上电压之后才统一方向排列好。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象 。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
电泳缓冲液类似色素提取的层析液，点样孔通常位于电极的负极端，由于DNA分子在缓冲液中带负电荷，在电场中DNA便向正极端移动，从而分离出大小不同的DNA片段。
DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。
凝胶中的DNA分子通过染色，在波长为300nm的紫外灯下才能被检测出来。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
5
二、材料用具
1.试剂
①无菌水、琼脂糖；
②电泳缓冲液（TAE或TBE）；
③凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；
④核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
二、DNA片段的扩增及电泳鉴定
2.材料用具
（1）试剂
①无菌水、琼脂糖；
②电泳缓冲液（TAE或TBE）；
③凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；
④核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
二、材料用具
2.用具
① PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
电泳装置
2.用具
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
微量离心管
PCR仪
注意：加不同样品时，需要更换枪头
DNA片段的扩增及电泳鉴定
5
三、方法步骤
1.PCR加样
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
材料 用量
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 （实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶 （即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
2.离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
3.扩增
三、方法步骤
3.扩增
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
三、方法步骤
加样
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
扩增
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
3.扩增
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，
以形成加样孔。
三、方法步骤
4.配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
5.制备凝胶
②凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
——加样孔侧连电极负极。
电泳缓冲液用来维持pH值，使DNA带负电荷。
三、方法步骤
6.电泳加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
凝胶载样缓冲液类似层析液
7.电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
四、注意事项
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、
枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成
小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放
在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，
移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
5
五、结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
五、结果分析与评价
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，
请分析产生这个结果的可能原因。
习题巩固
1.下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，
正确的是（ ）
A.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液
B.采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质
C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损
D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，
观察颜色变化
B
习题巩固
2.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关DNA片段
的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是（ ）
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前
必须进行高压蒸汽灭菌处理
B.PCR利用了DNA的热变性原理
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，
移液器上的枪头都必须更换
C
习题巩固
3.下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ）
A.电泳是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等
都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
C
习题巩固
4.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( 　　)
A.PCR产物的分子大小
在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因
的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
习题巩固
5.(2022·天津一中高二期中)下列有关电泳的叙述，
不正确的是（ ）
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等
都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
C
习题检测
6
习题检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的
Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。
判断下列相关表述是否正确。
afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（ ）
(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。
（ ）
(3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。
（ ）
√
×
×
习题检测
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。
下列有关PCR的叙述错误的是（ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
D
习题检测
1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，
发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，
在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。
请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
习题检测
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时,发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外,外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
习题检测
2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
习题检测
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是
，标记基因是 ，质粒pSYN 12424的作用是 。
ctrl 基因和psy基因
Pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
习题检测
（3）请查找相关资料，了解科学家为什么要培育“黄金大米”以及当前
关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。
你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。
习题检测
关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。
β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转人了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。
THANKS

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