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(共35张PPT)
1.2.2 微生物的选择培养和计数
自然界中微生物数量繁多，想要分离出特定的微生物，仅仅是通过平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
问
这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
同理：
人为提供有利于目的菌生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的条件，进行实验室微生物的筛选。
选择培养基
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
耐寒微生物
石油分解菌
被石油污染的土壤
冰川冻土层
选择培养基
Selective medium
（一）选择培养基
1.概念:
2.类型:
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
（1）改变培养条件。
70～80℃的高温
分离耐高温的水生栖热菌
使用将pH调至酸性的培养基
分离耐酸菌
（2）改变培养基中的营养成分。
不加碳源（含碳有机物）的培养基
不加氮源的培养基
分离出固氮菌
分离出自养型微生物
（3）添加某种化学物质。
加入青霉素
分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基
分离得到金黄色葡萄球菌
培养基中加氨苄青霉素
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
长出各种各样的细菌
选 择 培 养 基
培养基+氨苄青霉素
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
培养基
【思考】
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
基础培养基
选择培养基
那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
尿素的立体结构
【思考·讨论】
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。
尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
1.将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
问
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，缺乏脲酶的微生物不能分解尿素，而缺乏氮源的微生物是不能生长发育繁殖的。
利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
配方：
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
碳源
氮源
①提供无机盐；
②调节pH。
凝固剂
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4 ·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是_______________；该类培养基的主要用途为_______________。
2.从用途上来讲， 属于选择培养基，目的是为了获得 。
3.两种培养基共有的培养基成分有：
。
培养基一的碳源为 ，氮源为 ；
培养基二的碳源为 ，氮源为 。
固体
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数、保存
培养基二
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
微 生 物 的 选 择 培 养
Selective culture of microorganisms
（二）微生物的选择培养
方法:
稀释涂布平板法
主要过程:
A、梯度稀释菌液 B、涂布平板
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
由于土壤细菌的数量庞大，那么怎么获得要想得到特定微生物的纯培养物呢？
问
答
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
操作步骤:
（1）土壤取样
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
注意
（2）样品的稀释（梯度稀释菌液）
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
微量
移液器
（3）涂布平板
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
（4）菌落培养与观察
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；
2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；
3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
【特别提醒】
2.未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长，说明了什么？
未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
1.培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，为什么？
问
培养未接种的培养基的作用是对照。
微 生 物 的 数 量 测 定
Determination of the number of microorganisms
（三）微生物的数量测定
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
1.稀释涂布平板法
2.显微镜直接计数法
——间接计数法
——直接计数法
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
计数原则:
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
计算公式:
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
（234÷0.1）×106=2.34×109
答
B
例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
请评价这两位同学的实验结果的有效性：
1.甲同学____________________________________；
原因是____________________________________。
2.乙同学____________________________________；
原因是____________________________________。
实验操作不合理
未设置重复实验组
结果计算不合理
21与另外两组数值相差太大，应舍去
2.直接计数法 — 显微镜直接计数法
利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
缺点：
a.不能区分死菌和活菌→偏大。
b.不适于对运动细菌的计数。
c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。
优点：
快速、直观
血细胞计数板：
细菌计数板：
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
【探究 实践】
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
1.实验目的：
2.实验原理：
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
（1）土壤取样
（2）配制培养基
（3）样品的稀释与涂布平板
（4）微生物的培养与观察
取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤
取样过程：铲去表土（一般3cm左右）
注意事项：铁铲和取样袋在使用前都要灭菌；事毕洗手。
选择培养基*以尿素为唯一氮源
完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）——作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用
2.操作步骤：
①每个浓度至少设置4个平板
选择培养基（平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。
②本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。
例：标记注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目）
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
【思考讨论】
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
问
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
原理：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
鉴定培养基
方法：
呈碱性，遇酚红指示剂呈红色。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况；
固体培养基：
鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
原理 在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落
特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂
共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落 项目 选择培养基 鉴别培养基
原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长； 利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色)
图示
尿素分解菌
大肠杆菌
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
结果分析评价
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
3.回答下列与细菌培养相关的问题。(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是　　　　　　　(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 。硝化细菌在没有碳源的培养基上　　(填“能够”或“不能”)生长,原因是_______________________________________。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板　　　　(填“倒置”或“正置”)。 (3)单个细菌在平板上会形成菌落,研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物,原因是　　　　　　　　　　　　　　。 (4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过　　　处理,这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
蛋白胨
不同细菌生长繁殖所需的pH不同
能够
硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
倒置
在一定的培养条件下,不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
灭菌
4. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70 亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。
（2）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
可行，这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
（1）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？

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