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(共39张PPT)
第2章 细胞工程
首个体细胞克隆动物
克隆动物多莉羊
体细胞克隆猴
“中中”和“华华”
如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖？
希普：首例胚胎移植成功
哈里森:首创动物组织体外培养法
张明觉：发现哺乳动物精子获能现象
格登、童第周：体细胞核移植成功
试管家兔诞生
米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
山中伸弥：获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
【科技探索之路】动物细胞工程（含胚胎工程）的发展历程
第二节 动物细胞工程
动物细胞培养
动物细胞融合
动物细胞核移植
动物细胞工程常用的技术：
——动物细胞工程的基础
“人造肉”的故事
2000年第一个“能吃”的人造肉出现了，美国杜鲁大学支持的生物科学研究联合体用金鱼细胞培养出了人造鱼肉。2001年， 荷兰阿姆斯特丹大学的皮肤病专家韦特霍夫、内科医生艾伦和商人库顿宣布申请了制造人造肉的国际专利。2019年8月27日，肯德基和人造肉公司Beyond Meat合作，推出了第一款人造鸡肉产品。此次推出人造肉炸鸡，肯德基会先在亚特兰大的一家餐厅进行测试。产品包括黄金鸡块和无骨鸡翅。
美国马里兰大学的博士生贾森·马西尼找到了在实验室内制造"人造肉"的两种方法。一种是，首先从牛、猪、家禽或鱼的肌肉组织中提取细胞，在一个薄膜上进行培育。他们发现细胞会生长、扩张，然后从薄膜上脱落；等到脱落后的平面细胞群堆积到一定厚度时，就形成了肉；另一种是在一种三维颗粒中培育肌肉细胞。这样培育出的细胞组织可以用来制造肉制品，比如鸡米花和碎牛肉。
羽毛中提取细胞
人造肉
“人造肉”的获得利用的是什么技术？
动物细胞培养技术
2.2.1 动物细胞培养
动物细胞培养
1.概念：
从动物体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
2.过程：
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
3.原理：
4.目的：
细胞增殖
获得细胞或细胞产物
选取动物胚胎或幼龄动物的组织， 因为这些组织或细胞的生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强，容易培养。
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞培养及其应用
动物细胞培养的条件
Conditions of animal cell culture
动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，是因为机体给这些细胞提供了哪些条件？
（一）动物细胞培养的条件
充足的营养、稳定的内环境
体外培养动物细胞需要哪些必要条件呢？
问
答
糖类、氨基酸、无机盐、维生素 ……
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH
和渗透压
适宜的气体环境
将细胞所需的营养物质（糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）按种类和所需量严格配制的培养基。
1.营养条件
（1）培养基构成：
合成培养基
血清等一些天然成分
＋
合成培养基：
血清等一些天然成分：
含有尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质
（2）培养基类型：
液体培养基
（培养液）
血清
2.无菌、无毒的环境
（1）对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。
（2）在无菌环境下进行操作。
（3）培养液需要定期更换：
清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
另外：可根据实际情况适量添加抗生素。
无菌
无毒
3.温度、pH和渗透压
（1）适宜的温度：
哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃为宜；
（2）适宜的pH：
多数动物细胞生存的适宜pH为7.2-7.4；
（3）适宜的渗透压：
目的维持细胞正常的形态和功能
4.气体环境
（1）气体组成及作用：
O2
5%CO2
维持培养液的pH
细胞代谢所必需
（2）具体操作：
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
下列关于动物细胞培养所需要的条件的叙述，正确的是 ( 　)
A．为了创造无菌、无毒的环境，培养基中通常添加一定量的血清
B．动物细胞培养所需营养物质和植物组织培养的相同
C．动物细胞培养的适宜温度一般与动物的体温相近
D．动物细胞培养的适宜pH为酸性条件
C
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞培养及其应用
动物细胞培养的过程
The process of animal cell culture
（二）动物细胞培养的过程
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液中进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液中进行原代培养
CO2培养箱中培养
传代培养
1.取动物组织：
取材：胚胎或幼龄动物的组织或器官。
原因：细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养
动物相关组织的选择： 幼龄动物 or 老龄动物
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液中进行原代培养
CO2培养箱中培养
传代培养
2.动物组织处理，制成细胞悬液：
（1）将组织分散成单个细胞：
a.动物体内的组织团块中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和繁殖。
机械法
酶解法（胰蛋白酶、胶原蛋白酶）
b.使细胞与培养液充分接触，保证细胞所需要的营养供应，细胞内有害代谢物的及时排出。
（2）用培养液将细胞制成细胞悬液，于适宜的环境中培养。
方法：
原因：
【思考 讨论】
1.常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
说明细胞间的物质主要是蛋白质。
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
2.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？如果会的话如何处理？
细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解蛋白质，因此，胰蛋白酶可能会把细胞消化掉。
因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长。
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液中进行原代培养
CO2培养箱中培养
传代培养
3.将细胞悬液放入培养液进行原代培养
（1）原代培养：
动物组织经过处理后的初次培养。
（2）体外培养的动物细胞类型：
①悬浮生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖。
②贴壁生长类：（大多数细胞）
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
接触抑制
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液中进行原代培养
CO2培养箱中培养
传代培养
细胞密度过大
有害代谢物积累
培养中营养物质缺乏
（3）培养过程中出现的问题：
细胞分裂受阻
原因：
解除措施：
悬浮生长类
贴壁生长类
接触抑制
贴壁生长类
对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。
对分瓶后的细胞培养
传代培养
1.不同培养类型的细胞进行传代培养时，如何处理？
悬浮生长类细胞：
贴壁生长类细胞：
【思考 讨论】
直接用离心法收集
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
原代培养→分裂受阻→离心法收集→制成细胞悬液→传代培养
原代培养→分裂受阻→先胰蛋白酶处理→再离心法收集→制成细胞悬液→传代培养
2.动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶的目的？
第一次使用的目的是使组织细胞分散开；
贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。
可以通过胰蛋白酶处理的对象来区分两种“培养”
第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细胞后进行培养，为原代培养。
第二次：细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，然后，将其分散到多个培养瓶中继续培养，为传代培养。
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液中进行原代培养
CO2培养箱中培养
传代培养
4.传代培养：
部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止。
大部分细胞衰老死亡
少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展。
10~50代：
50代以后：
（有限细胞系）
（无限细胞系）
使用或保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)。
细胞系的遗传物质一定改变
这一阶段的细胞称为细胞株
动物细胞培养的过程
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
放入CO2培养箱中培养
细胞贴壁
接触抑制
机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
分散成单个细胞
植物组织培养与动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理（及是否体现细胞全能性） （ 全能性）
（ 全能性）
培养基 培养基 培养基
过 程 外植体 ↓脱分化 　↓再分化 芽、根或胚状体 ↓生长发育 植物体 动物的组织
　机械法↓或酶处理
细胞悬液
↓
↓
细胞悬液
↓
结 果
相同点 ①两技术手段培养过程中都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂； ②均需要无菌操作、无菌培养，需要适宜的温度、pH等条件
植物细胞的全能性
体现
细胞增殖
未体现
固体
液体
愈伤组织
原代培养
传代培养
新的植物体
新的细胞群
（1）动物细胞培养体现了动物细胞的全能性 （　 　）
（2）培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞 （　 　）
（3）悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集 （　 　）
（4）动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH （　　 ）
判断常考语句，澄清易混易错
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞培养及其应用
干细胞培养及其应用
Stem cell culture and its application
（三）干细胞培养及其应用
1.干细胞的概念：
2.干细胞的来源：
3.干细胞的类型：
动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞即为干细胞，在一定的条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
（1）胚胎干细胞（简称 ES 细胞）
（2）成体干细胞
胚胎干细胞（ES细胞）
1.分布：
2.特点：
3.应用实例：
4.局限性：
存在于早期胚胎（8细胞期之前含8细胞期）中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等
必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
成体干细胞
1.分布：
2.种类：
3.特点：
存在于成体组织或器官内的干细胞
造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）
神经干细胞（神经系统中）
精原干细胞（睾丸中）
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
4.作用：
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
5.应用实例：
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病
（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。
造血干细胞：
神经干细胞：
【拓展】
诱导多能干细胞
iPS细胞
1.概念：
2.诱导方法：
3.诱导多能干细胞优点：
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞）。
a.借助载体将特定基因或特定蛋白导入细胞
（成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞均可）
b.用小分子化合物诱导形成。
a.诱导过程无须破坏胚胎；
b.iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
诱导多功能干细胞（iPS细胞）
临床治疗人类疾病
如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
取成纤维细胞
转入相关因子
细胞转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
比较项目 胚胎干细胞 成体干细胞 诱导多能干细胞
来源 诱导高度分化的组织细胞形成
特点 具有分化成为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。 具有 ，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 类似胚胎干细胞；诱导无须破坏胚胎，应用前景更广泛。
早期胚胎
成体组织或器官中
组织特异性
干细胞应用面临的问题存在存在着导致肿瘤发生的风险。
应用展望：干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
动物细胞培养
动物细胞培养的概念和原理
干细胞培养及其应用
营养条件；无菌、无毒的环境；温度、pH和渗透压；气体环境
原理：细胞的增殖
在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
干细胞的分布
干细胞的类型
干细胞的应用
胚胎干细胞（ ES细胞）
成体干细胞
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
取动物组织
单个细胞
细胞悬液
原代培养
传代培养
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
主要应用在医学上
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。 （ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。 （ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清 （ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖 （ ）
一、概念检测
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是 ( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
A

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